[发明专利]一种特异性降低山羊卵泡颗粒细胞CPEB1基因和蛋白表达水平的siRNA及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物学领域，具体涉及一种CPEB1基因和CPEB1蛋白在卵泡颗粒细胞中的敲低的方法。

背景技术

胞质多聚腺苷酸化元件结合蛋白(CPEBs)是一组高度保守的RNA结合蛋白，其作用机制是通过与mRNA3'UTR的特定序列CPEBs元件的结合来促进mRNA胞质多聚腺苷酸化诱导的翻译过程，从而使这类mRNA的翻译表达具有时间特异性和空间特异性。CPEBs最早在非洲爪檐卵母细胞的减数分裂研究过程中被发现，它被认为可调控减数分裂期转录沉默的非洲爪赡卵母细胞生长发育中母源性mRNA的多聚腺苷化和翻译过程。随后的研究发现，CPEBs在细胞的生长发育、细胞的周期调节、细胞衰亡、肿瘤发生和发展、记忆突触可塑性等方面起着重要的作用。在对脊椎动物体研究中，研究人员发现了CPEBs蛋白家族中的四个家族成员CPEB1～4，而CPEB1是该家族中关系较远的成员并和CPEB2～4属于不同的蛋白，它们虽然有相同的RNA结合基序元件，但有不同的调控区域和各自独特的生物学功能及表现型。

目前的硏究结果己经证实，CPEB1能够通过调节polyA尾的长度来激活或抑制mRNA的翻译。polyA尾长度的暂时调控能够弥补细胞分裂过程中转录的缺失，同时是调控细胞有丝分裂的一种常规机制。有丝分裂时期细胞的增殖需要CPEB1的参与。同时，CPEB1通过参与纺锤体和联会复合体的形成来调控细胞减数分裂，CPEB1对纺锤体和联会复合体的形成有着促进作用。从卵母细胞发生过程来看，排卵前卵母细胞中的CPEB1基因发生过表达并导致细胞周期蛋白CYCLIN B表达量增加。而CYCLIN B与CDK结合形成MPF，推进细胞由G2期进入M期，减数分裂过程中CYCLIN B的表达水平越高，其对细胞的增殖促进能力就越强。所以认为，CPEB1参与细胞周期蛋白CYCLIN B的合成过程，并且是通过上调CYCLIN B表达水平以及加速纺锤体的形成的途径在减数分裂过程中发挥作用，并促进卵母细胞的生长发育。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活性及基因表达的监控机制，是指内源性或外源性与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)，在细胞内特异地降解该mRNA，从而致使特异性的基因有效封闭的过程。由于这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。研究中导入的双链RNA多为21-23nt的小分子干扰RNA片段(small inter-fering RNAs，简称siRNAs，又称引导RNAs)，引起的RNAi效应较强。

由于RNAi可以作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具，它正在基因表达调控和基因功能研究中发挥重要作用。目前，RNAi已发展成为一种广泛的、用于产生遗传敲除的技术，并且用于通过反向遗传学研究基因功能。RNAi技术作为一个强有力的反向遗传学工具，不仅提供了高效、特异性的抑制基因表达的手段，而且正成为基因功能研究、抗病毒感染研究和基因治疗研究的重要技术方法。

本研究则是利用合成特异的siRNA，以特异性降低山羊卵泡颗粒细胞中CPEB1基因及CPEB1蛋白的表达水平。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异的siRNA，可以特异性降低山羊卵泡颗粒细胞内CPEB1基因和CPEB1蛋白表达水平。

本发明所述的特异性降低山羊卵泡颗粒细胞CPEB1基因和CPEB1蛋白表达水平的siRNA，是siCPEB1-3，其序列如SEQ ID No.9-10所示。

本发明提供了一种降低山羊卵泡颗粒细胞内CPEB1基因和CPEB1蛋白表达水平的方法，是将上述特异的siRNA与转染试剂混合加入山羊卵泡颗粒细胞培养液中培养卵泡颗粒细胞；转染48小时后降低CPEB1基因和CPEB1蛋白表达水平。

本发明中所使用的转染试剂为深圳欣博盛生物科技有限公司的HD Transfection Reagent。其他转染试剂也能达到同样的效果，像Invitrogen公司的Lipofectamine 2000，和BBI的LipoHigh脂质体高效转染试剂，都有比较好的转染效果。