[发明专利]一种成体人肝源性干细胞系HN及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种成体人肝源性干细胞系HN，其特征在于它为成体人肝源性干细胞HN，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2017年5月15日，保藏号为CGMCC No.13844。

2.一种成体人肝源性干细胞系HN的制备方法，其特征在于它的制备方法包括以下步骤：

(1)取肝血管瘤患者切下来的瘤旁正常肝组织；

(2)在无菌条件下行门静脉插管，并进行原位灌流以去除血细胞；

(3)用0.05％胶原酶溶液循环灌注以离散肝组织；

(4)将步骤(3)灌流后的肝组织置于120目铜网上剪碎组织并研磨以获得单细胞悬液；

(5)收集步骤(4)的单细胞悬液并于4℃条件下1500rpm离心5分钟以得到细胞沉淀；

(6)将步骤(5)的细胞沉淀重悬于蛋白酶E溶液中在37℃条件下孵育60分钟以去除肝细胞；

(7)向步骤(6)去除肝细胞悬液中加入等体积的含10％胎牛血清的DMEM培养基，混合均匀后经孔径40μm尼龙膜过滤；

(8)将步骤(7)滤液上样至浓度为1.35g/mL和1.70g/mL Percoll不连续密度梯度介质上，在4℃条件下2000rpm离心20分钟；

(9)收集两层密度梯度介质间的细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养基洗3次，于4℃条件下1500rpm离心5分钟，弃去上清液；

(10)将步骤(9)的细胞沉淀重悬于完全培养基中，按2.5×10⁴/cm²接种细胞悬液于胶原包被的组织培养皿中，置于37℃，5％的CO₂培养箱中培养；

(11)每隔1天更换1/2量的新鲜完全培养基一次；

(12)待细胞形成克隆后，应用克隆环挑取上皮克隆细胞置于新的培养瓶中继续培养，即得成体人肝脏干细胞；

(13)酸化处理：将获得的成体人肝脏干细胞的原代细胞培养至第30天进行酸化，将培养液pH值调到6.3～6.8；培养24小时或36小时后，换完全培养基继续培养；

(14)低血清筛选培养：原代细胞酸化7～10天后，每2天按1％的量减少胎牛血清，将10％胎牛血清培养液减到1％胎牛血清培养液后，继续培养直到镜下见到部分细胞增殖后，换完全培养基进行传代培养；

(15)待细胞长至90％汇合时应用胰蛋白酶溶液消化，常规传代培养。

3.根据权利要求2所述的一种成体人肝源性干细胞系HN的制备方法，其特征在于完全培养基主要成分如下：含10％胎牛血清、0.3U/mL胰岛素、0.3ng/mL表皮细胞生长因子、0.2ng/mL干细胞生长因子、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基。

4.一种成体人肝源性干细胞系HN的应用，其特征在于它在体内外定向诱导肝细胞中的应用。

5.一种成体人肝源性干细胞系HN的应用，其特征在于它在制备生物人工肝中的应用。

6.一种成体人肝源性干细胞系HN的应用，其特征在于它在治疗疾病中的应用。

7.根据权利要求6所述的一种成体人肝源性干细胞系HN的应用，其特征在于它在抗急慢性肝衰竭、酒精性脂肪肝及抑制肝纤维化和抗肿瘤作用中的应用。