[发明专利]一种羰基还原酶基因工程菌固定化细胞及其应用

说明书

本发明提供了一种利用固定化大肠杆菌(E.coli)工程菌细胞催化合成他汀类药物手性中间体(3R,5S)‑6‑氯‑3,5‑二羟基己酸叔丁酯与(3R,5R)‑6‑氰基‑3,5‑二羟基己酸叔丁酯的方法。包括含羰基还原酶大肠杆菌工程菌的培养、固定化细胞的制备、固定化细胞催化新型药物手性中间体(3R,5S)‑6‑氯‑3,5‑二羟基己酸叔丁酯与(3R,5R)‑6‑氰基‑3,5‑二羟基己酸叔丁的合成。本发明方法采用固定化生物大肠杆菌工程菌细胞为催化剂，稳定性好，使用寿命长，有机溶剂耐受性好，可多次重复利用，并且无需昂贵的外源辅酶添加，可在有机相反应体系中催化他汀药物中间体的合成，产品产率与纯度高，并可大幅度降低生产成本，简化工艺步骤，减少“三废”排放，在他汀类药物手性中间体的工业化生产中具有极高应用价值。

(一)技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种固定化含羰基还原酶微生物细胞的方法及以固定化细胞为催化剂，合成他汀类药物中间体(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯和(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法。

(二)背景技术

进入新世纪以来，心脑血管疾病已经成为我国乃至全球范围内危害人类生命健康的首要疾病。他汀类药物可通过抑制HMG-CoA还原酶，有效降低血脂水平，防止动脉粥样硬化和冠心病的发生，是国内外心脑血管疾病防治的重大基础药物。(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯和(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯参与构筑他汀类药物的主要药效基团，是新型他汀类药物瑞舒伐他汀钙、阿托伐他汀钙与匹伐他汀钙合成的关键手性中间体，在新型他汀类药物的合成中占有重要地位。目前工业上对(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯或(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的合成主要是采用化学法羰基底物不对称还原法制备。具体是以硼氢化物为还原剂，利用手性噁唑硼烷、过渡金属配合物等手性催化剂催化潜手性底物的羰基不对称还原。该技术立体专一性控制困难，反应过程非对映诱导不充分，产物光学纯度低；且反应需在深冷条件下加氢，设备要求高；所用手性催化剂价格昂贵，生产成本高；硼氢化物易燃易爆，安全隐患大，反应产生的硼化物废物处理困难，不符合绿色化学的理念。

生物催化法因其具有高立体专一性、原子经济性、生产过程绿色等优势，在手性医药中间体合成中具有极大的开发价值。羰基还原酶(Carbonyl reducatase)可催化潜手性羰基的不对称还原，具有高化学、区域和立体选择性的突出优势，并且反应条件温和、原子经济性高、环境友好。利用羰基还原酶生物催化羰基不对称还原已成为近年来开发(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯和(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯新型合成技术的研究热点，目前已有多种不同来源(Saccharomyces cerevisiae、Pichia angusta、Pichia haplophila、Beauveriabassiana等)的羰基还原酶可用于上述产品的合成。采用羰基还原酶与葡萄糖还原酶共表达工程菌细胞，进行催化反应，可以实现辅酶NAD(P)H循环，无需额外昂贵辅酶添加，进行(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯和(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的高底物浓度与高时空产率合成。Kizaki等利用来源于CandidamagnoliaIFO 0705的羰基还原酶基因与Bacillus megaterium IA1030中得到的葡萄糖脱氢酶基因在大肠杆菌中进行共表达，底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯浓度为200g/L，反应24h，(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯产率达97.2％，d.e.值98.5％。Codexis公司对来源于Saccharomyces cerevisiae的一株羰基还原酶(GenBank No.NP010159.1)进行了分子改造并与葡萄糖脱氢酶共表达并用于(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的合成，在不添加外源性辅酶的情况下，反应7h，产物d.e.值大于99.5％，时空产率达到120g/(L·d)。