[发明专利]一种抽葶大青的组织培养与离体再生方法

说明书

本发明是一种抽葶大青的组织培养与离体再生方法，包括外植体的选择与消毒、愈伤组织的诱导、不定芽的分化诱导以及壮苗生根等步骤。本发明以抽葶大青幼苗叶片为外植体，首次对抽葶大青的组织培养体系进行了探索，确立了无菌材料的获得、愈伤组织的诱导、不定芽的分化诱导、壮苗与生根等理想培养条件，最终成功建立了抽葶大青的无性繁殖体系，对抽葶大青药材资源的充分利用、遗传改良及无性系苗木的培育等提供一定的理论与技术依据。本发明的培养方法优点在于愈伤组织的诱导与不定芽的分化一步完成，操作简单，节省工作量的同时大大缩短培养的时间，可以在短时间里生产大量组培苗，不仅繁殖率高，而且苗的质量好，适合工厂化生产。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种抽葶大青的组织培养与离体再生方法。

背景技术

抽葶大青(Clerodendrum subscaposum)系马鞭草科大青属多年生落叶或常绿灌木，全株入药，其花可安神、止血，主治心悸失眠、痔疮出血；叶能祛风散瘀、解毒消肿，主治偏头痛、跌打瘀肿、痈肿疮毒；根、茎可清肺热、利小便、凉血止血，临床用于肺热咳嗽、热淋、小便不利、咳血、尿血、痔疮出血、风湿骨痛的治疗。

抽葶大青茎直立，不分枝或少分枝，小枝四棱形。叶交互对生，薄革质，具长柄，叶片心形或卵圆形，顶端骤尖或渐尖，基部心形，边缘具细齿，叶面散生小粗伏毛。总状圆锥花序顶生，向一侧偏斜。花小，但花丝长；花萼、花冠、花梗均,为鲜艳的深红色，花期长，核果近球形，熟时蓝黑色，外包以红色宿萼；花、果期5-11月。

性喜高温、湿润、半荫蔽的气候环境，喜土层深厚的酸性土壤，耐荫蔽，耐瘠薄，忌干旱，忌涝，畏寒冷，生长适温为23～30℃。主要产于我国江苏、浙江南部、江西南部、湖南、福建、台湾、广东、广西、四川、贵州和云南；印度东北、孟加拉、锡金、不丹、中南半岛、马来西亚、日本也有分布，常生于平原、山谷、溪边或疏林中或栽培于庭园。

查阅相关文献，抽葶大青通过组织培养实现快繁的相关方法仍未见报告，因此，急需探索一种能实现快速繁殖的方法以满足现代生产的需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种抽葶大青的组织培养与离体再生方法，以抽葶大青叶片为外植体，通过实验探索，首次建立起抽葶大青的组培快繁体系，为抽葶大青药用资源的充分利用提供了一定理论和技术依据。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种抽葶大青的组织培养与离体再生方法，包括如下顺序的步骤：

(1)外植体的选择与消毒：选择抽葶大青幼苗叶片为外植体，洗净泥土，放入烧杯中，加入水和少量洗衣粉，轻轻摇晃5min，再用清水冲洗2h，将洗衣粉冲洗干净；最后转至超净工作台上，用75％(v/v)的乙醇溶液消毒3-5s，无菌水洗2次，利用0.1％的含有吐温的升汞溶液消毒4-5min，无菌水洗5-6次备用；

(2)愈伤组织的诱导：在无菌操作下，将消毒好的叶片剪成面积为1-1.5cm²片状，以叶片正面向上的方式平放接种至愈伤组织诱导培养基中，温度23±2℃、空气相对湿度50％-60％、光照强度2000Lx、光照时间12小时/天培养20天，使叶片切口处均长出2-6mm厚的一圈致密型、淡绿色、块状愈伤组织；

(3)不定芽的分化：愈伤组织继续在上述培养条件下继续培养约10-12天，使愈伤组织上分化出深绿色、状态正常、数量极多的小芽；

(4)芽的壮苗培养：分化出的不定芽连同愈伤组织及时切下，接入壮苗培养基中，温度23±2℃、空气相对湿度50％-60％、光照强度2000Lx、光照时间12小时/天，培养天数25-30天使苗高为3-5cm；

(5)生根培养：将步骤(4)培壮后的小苗单株切下，接入生根培养基中，温度23±2℃、空气相对湿度50％-60％、光照强度2000Lx、光照时间12小时/天，培养20-30天使幼苗生长3-4条、长度为2-4cm的不定根。