[发明专利]由人类多能干细胞产生间充质干细胞的方法以及通过所述方法产生的间充质干细胞

说明书

本申请是申请号为200980163164.3，申请日为2009年10月28日，发明名称为“由人类多能干细胞产生间充质干细胞的方法以及通过所述方法产生的间充质干细胞”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种由人类多能干细胞诱导间充质干细胞的方法、通过所述方法产生的间充质干细胞以及包含间充质干细胞的细胞治疗产品。

背景技术

干细胞是能够分化为构成有机体组织的多种细胞的细胞，且一般指分化之前的未分化细胞，其可获自胚胎、胎儿和成人身体的各个组织。干细胞通过分化刺激(环境)分化为特定细胞；与因分化完成而引起其细胞分裂已停止的细胞不同，干细胞允许通过经由细胞分裂(自我更新)产生与其本身相同的细胞来进行增殖(扩增)；且由于在不同环境下或通过不同的分化刺激，干细胞可分化为其它细胞，因此干细胞在分化过程中具有可塑性。

干细胞根据其分化能力可分为多能(pluripotent)、多效(multipotent)和单能(unipotent)干细胞。多能干细胞为具备全能性以分化为所有细胞的多能细胞，且这些多能干细胞包含胚胎干细胞(ES细胞)以及诱导性多能干细胞(iPS细胞)等。成体干细胞可为多效和/或单能干细胞的实例。

胚胎干细胞由早期胚胎发育中胚细胞的内细胞团形成；具备全能性以分化为所有细胞从而使得其能够分化为任何种类的组织细胞；可以永生和未分化状态的形式培养；与成体干细胞不同，可通过生殖细胞的制备遗传到下一代(汤姆逊(Thomson)等人，科学(Science)，282，1145-1147，1998；瑞比诺夫(Reubinoff)等人，自然生物技术(Nat，Biotechnol.)，18；399-404，2000)。

通过在人类胚胎形成的时候仅分离并培养内细胞团来制备人类胚胎干细胞，且当前，已从灭菌操作后剩余的冷冻胚胎中获得全局制备的人类胚胎干细胞。为使用能够分化为所有细胞的多能人类胚胎干细胞作为细胞治疗产品，已进行了各种尝试；然而，这些尝试尚未完全克服例如致癌和免疫排斥风险高等障碍。

作为对这些尝试的一种补充，最近已对诱导性多能干(iPS)细胞进行了报道。包含在多能干细胞概念中的iPS细胞为通过去分化成体细胞获得的细胞，所述成体细胞的分化以若干方式结束，因而在分化的早期阶段恢复为胚胎样状态。到目前为止，已有报道称鉴于基因表达和分化能力，去分化的细胞呈现出与胚胎干细胞(其为多能干细胞)几乎相同的特性。这些iPS细胞还可使用自体细胞，因而排除了免疫排斥的风险，然而肿瘤发生的风险仍然是需要解决的问题。

近来，已提供了具有免疫调节功能并且无肿瘤发生风险的间充质干细胞作为用于解决这些问题的替代方法。间充质干细胞为能够分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞、心肌细胞等的多效细胞，且已报道具有调节免疫反应的功能。间充质干细胞可从各种组织分离出来并培养，但它们的能力和细胞表面标记依据其来源而互不相同。因此，并不容易清楚地界定间充质干细胞。然而，间充质干细胞通常由可分化为骨细胞、软骨细胞和肌细胞的细胞界定；具有螺旋形式；并且表达CD73(+)、CD105(+)、CD34(-)和CD45(-)，这些是基本的细胞表面标记。

同时，为使间充质干细胞用作细胞治疗产品，再生医学和/或细胞治疗领域所需的约1×10⁹最少数量的细胞需得到满足。然而，在考虑用于设定条件和标准的实验时，实际需要的细胞数量进一步增加。因此，体外实验中需要至少10次传代以由获自各种来源的现有间充质干细胞提供所述量的细胞。在这种情况下，细胞变得老化并经修饰，因此，它们可能不会再适于用作细胞治疗产品。虽然已通过使用这些细胞来设定条件和标准，但可能会出现一些问题：这些细胞可能在实际用于治疗中之前就已变得枯竭，从而需要使用来自他人的间充质干细胞，且在这种情况下，由于使用不同的细胞而需要进行额外的实验。

解决现有间充质干细胞培养系统的上述问题的最理想替代方法是使用人类多能干细胞来产生间充质干细胞。然而，到目前为止，诱导人类多能干细胞分化为间充质干细胞已需要由特定细胞因子(例如，BMP、bFGF)进行诱导程序(这成本很高且需要控制浓度)或对具有异种病原体风险的异种饲养细胞(OP9小鼠细胞株)进行诱导程序以及其后通过特定标记(例如CD73)进行分选。