[发明专利]一种人脐带间充质干细胞的无血清冻存液

说明书

本发明提供一种人脐带间充质干细胞的冻存液，属于干细胞培养技术领域，是适合临床应用的干细胞冻存液的组合物。采用多种成分对冻存条件进行优化，其体积百分比为含人脐带间充质干细胞无血清培养基65%‑75%、人血白蛋白9‑12%、二甲基亚砜9‑12%、腺苷3‑5.5%、以及人脐带间充质干细胞来源的外泌体溶液2.5‑5%和人脐带间充质干细胞来源的短肽和多肽类化合物溶液2.5‑5%的混合溶液。脐带间充质干细胞在上述冻存液中复苏后贴壁率达到95%以上，传代培养及扩增之后分析，流式细胞术结果显示干细胞的特性稳定。冻存液中不含胎牛血清，防止了外源性不明成分和病原性污染，有效保证干细胞治疗产品的质量稳定和标准化，为用于临床治疗奠定了基础。

技术领域

本发明涉及干细胞培养技术领域，具体地说是一种人脐带间充质干细胞的无血清冻存液。

背景技术

人脐带间充质干细胞是指从脐带中分离的一种多能干细胞，与其他来源的间充质干细胞比较有明显的临床应用优势，如取材容易、易收集、冷冻保存及相对纯净等，具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化，如成骨细胞、软骨细胞、类肝细胞、类胰岛素细胞、神经细胞和心肌细胞等，且无伦理方面的问题。目前，人脐带间充质干细胞已经在临床领域得到应用并取得令人鼓舞的治疗效果。

人脐带间充质干细胞的种子库在临床上已经广泛应用，但也存在受冻存条件限制而不能大规模应用的问题，干细胞的冻存过程中无外源性污染是脐带间充质干细胞在临床治疗应用中安全可靠的关键，一方面由于常规冻存液中的胎牛血清含有各种不明确的细胞生长因子，会对细胞的分化形成干扰，另一方面采用动物血清培养的干细胞进行临床应用，可能引起病原体的交叉感染，因此需要开发成分明确的人脐带间充质干细胞无血清冻存液。

人脐带间充质干细胞种子库细胞的长期活性与冻存坏境有密切关系，冻存液的微环境对人脐带间充质干细胞有着重要影响，当细胞微环境出现变化的时候可直接影响干细胞的形态、增殖、分化、凋亡和衰老，且细胞的生物学特性和遗传稳定性都可能发生变化，优化干细胞的冻存条件将为干细胞技术的规范化应用起到积极意义。

发明内容

本发明的技术任务是解决现有冻存条件的不足，提供一种脐带间充质干细胞的冻存液，解决常规冻存液中胎牛血清带来的动物源性成分和病原体污染问题，减少细胞死亡并维持干细胞特性。脐带间充质干细胞在无血清冻存液中保存在液氮中14天后重新复苏后贴壁率达到95%以上，死细胞很少，大大提高了细胞的活性与数量，同时流式细胞术检测细胞表型时, 阳性表达CD90/CD44/CD73/CD105，阴性表达CD34/CD45/CD19/CD11b/HLA-DR,干细胞特性没有变化。

一）本发明的技术方案是按以下方式实现的，该实验方法的步骤是：

1）本发明提出的一种脐带间充质干细胞冻存液, 是含各成分的体积百分比为：预先制备的人脐带间充质干细胞无血清培养基65%-75%、人血白蛋白9-12%、二甲基亚砜9-12%、腺苷3-5.5%、以及人脐带间充质干细胞来源的外泌体溶液2.5-5%和人脐带间充质干细胞来源的短肽和多肽类化合物溶液2.5-5%的混合溶液。

2)具体实施方式中，冻存液是含人脐带间充质干细胞无血清培养基的体积百分比可以为65%，67%，69%，71%，73%，75%；人血白蛋白的体积百分比可以为9%，9.5%，10%，10.5%，11%，12%；二甲基亚砜体积百分比可以为9%，9.5%，10%，10.5%，11%，12%、腺苷的体积百分比可以为3%，3.5%，4%，4.5%，5%，5.5%，以及人脐带间充质干细胞来源的外泌体溶液体积百分比可以为2.5%，3%，3.5%，4%，4.5%，5%、人脐带间充质干细胞来源的短肽和多肽类化合物溶液的体积百分比可以为2.5%，3%，3.5%，4%，4.5%，5%的混合溶液。