[发明专利]一种血管内皮因子检测试剂盒的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域，尤其涉及一种血管内皮因子检测试剂盒的制备方法。

背景技术

血管内皮生长因子(英文：vascular endothelial growth factor，简称：VEGF)，早期亦称作血管通透因子(英文：vascular permeability factor，简称：VPF)，是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子(heparin-binding growth factor)，可在体内诱导血管新生(induce angiogenesis in vivo)。该因子能有效的促进血管再生，对医疗研究由重要作用。

目前，检测血管内皮因子的方法主要还是放射免疫分析法，但众所周知，放射免疫分析法具有一定的放射性污染，且应用仪器比较昂贵。

因此，目前急需一种无污染、操作成本低的血管内皮因子检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种无污染、操作成本低的血管内皮因子检测试剂盒的制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种血管内皮因子检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

(1)按照下列组分含量配制试剂R1：

试剂R1：

其溶剂为纯化水；

①按照上述试剂R1的组分含量，将Tris溶于纯化水中，搅拌均匀，调节pH，配制成R1缓冲液；

②按照上述试剂R1的组分含量，将NaN₃、海藻糖、曲拉通、PEG-2000溶于R1缓冲液中，搅拌均匀，待所有原料充分溶解，即制得试剂R1；

(2)按照下列组分含量配制试剂R2：

试剂R2：

其溶剂为纯化水；

①按照上述试剂R2的组分含量，将Tris溶于纯化水中，搅拌均匀，调节pH，配制成R2缓冲液；

②按照上述试剂R2的组分含量，将NaCl、NaN₃、BSA、甘油溶于R2缓冲液中，搅拌均匀，即得R2分散液；

③制备胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体：

a.取粒径为80nm和120nm的胶乳微球于MES缓冲液中，加入EDAC溶液混匀后于37℃环境中孵育混匀1h，离心去上清；再加入NHS溶液恢复至原体积后，混匀于37℃环境中孵育混匀1h，离心去上清，得混合微球乳液；

b.在混合微球乳液中加入聚乙烯对氯甲基苯乙烯共聚物，共聚80nm和120nm粒径的胶乳；离心沉淀，将剩余物质分散于MES缓冲液中，反复2-4次，最后于MES缓冲液中恢复至原体积，再加入血管内皮因子多克隆抗体，于37℃下反应3-4h，离心，将沉淀物分散于原体积的PBS缓冲液中，反复2-4次，最后将沉淀物分散于原体积的NHS缓冲液中，加入BSA；

c.2-8℃封存45-50h，得最终所需的胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体；

④用R2分散液来溶解得到的胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体，超声分散，最终制得试剂R2；其中，聚乙烯对氯甲基苯乙烯共聚物在试剂R2中的最终浓度为9％-11％。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，试剂R1的Tris缓冲液的pH为7.5。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，试剂R2的Tris缓冲液的pH为7.5。

作为本发明的优选方式之一，所述制备胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体的步骤a中，采用的MES缓冲液为100mM MES缓冲液。

作为本发明的优选方式之一，所述制备胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体的步骤a中，采用的EDAC溶液为50g/L的EDAC溶液。

作为本发明的优选方式之一，所述制备胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体的步骤a中，采用的NHS溶液为50g/L的NHS溶液。

作为本发明的优选方式之一，所述制备胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体的步骤b中，加入的BSA为30g/L的BSA。

本发明相比现有技术的优点在于：

(1)采用本方法制备的试剂盒具有较高的检测灵敏度，操作简单、快速，从检测到出结果只需10分钟；

(2)胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体的制备过程中，采取了不同粒径的胶乳微球混合使用，大大提高了试剂盒的灵敏度和线性范围；

(3)采用本方法制备的试剂盒与样品所形成的抗原抗体复合物，稳定性佳，在特定波长下有一定的吸光度，特异性强；