[发明专利]一种Ⅳ型胶原蛋白检测试剂盒的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域，尤其涉及一种Ⅳ型胶原蛋白检测试剂盒的制备方法。

背景技术

胶原是一种纤维状糖蛋白，它是由三股螺旋体形成的α-肽链网状结构。目前已发现胶原达10种之多，存在于不同组织。Ⅳ型胶原蛋白是构成基底膜的重要成分。正常肝内基底膜主要存在于血管、淋巴管、胆管周围，肝窦壁处缺乏。在肝病时随炎症发展，纤维组织增生活跃，纤维组织生成过程中有大量胶原沉积，各种胶原均有所增加，但其中最为重要的就是构成基底膜的Ⅳ型胶原蛋白的增加。目前认为，Ⅳ型胶原蛋白的测定可作为检查肝纤维化的近代指标。

目前，检测Ⅳ型胶原蛋白的方法主要是放射免疫分析方法，但放射免疫分析方法的具体操作相对繁琐，且存在一定的放射污染，投入多等问题。

因此，目前急需一种操作简单、无污染、成本低的Ⅳ型胶原蛋白检测试剂盒的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种操作简单、无污染、成本低的Ⅳ型胶原蛋白检测试剂盒的制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种Ⅳ型胶原蛋白检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

(1)按照下列组分含量配制试剂R1：

试剂R1：

①按照上述试剂R1的组分含量，配制MOPSO缓冲液，并用稀盐酸或氢氧化钠调节pH，作为R1缓冲液；

②按照上述试剂R1的组分含量，将NaCl、NaN₃、阿拉伯胶、Tween-80、PEG-2000溶于R1缓冲液中，搅拌均匀，待所有原料充分溶解，即制得试剂R1；

(2)按照下列组分含量配制试剂R2：

试剂R2：

①按照上述试剂R2的组分含量，配制MOPSO缓冲液，并用稀盐酸或氢氧化钠调节pH，作为R2缓冲液；

②按照上述试剂R2的组分含量，将NaCl、NaN₃、BSA、甘油溶于R2缓冲液中，搅拌均匀，即得R2分散液；

③制备胶乳包被的Ⅳ型胶原蛋白多克隆抗体：

a.取粒径为80nm和120nm的胶乳微球于MES缓冲液中，加入EDAC溶液混匀后于37℃环境中孵育混匀1h，离心去上清；再加入NHS溶液恢复至原体积后，混匀于37℃环境中孵育混匀1h，离心去上清，得混合微球乳液；

b.在混合微球乳液中加入上述组分含量的聚乙烯对氯甲基苯乙烯共聚物，在37℃温度下反应1-3h，共聚80nm和120nm粒径的胶乳；离心沉淀，将剩余物质分散于MES缓冲液中，反复2-4次，最后于MES缓冲液中恢复至原体积，再加入Ⅳ型胶原蛋白多克隆抗体，于37℃下反应3-4h，离心，将沉淀物分散于原体积的PBS缓冲液中，反复2-4次，最后将沉淀物分散于原体积的NHS缓冲液中，加入BSA；

c.2-8℃封存45-50h，得最终所需的胶乳包被的Ⅳ型胶原蛋白多克隆抗体；

④用R2分散液来溶解得到的胶乳包被的Ⅳ型胶原蛋白多克隆抗体，超声分散，最终制得试剂R2；其中，聚乙烯对氯甲基苯乙烯共聚物在试剂R2中的最终浓度为9％-11％。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，R1缓冲液的pH为6.5。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，R2缓冲液的pH为6.5。

作为本发明的优选方式之一，所述制备胶乳包被的Ⅳ型胶原蛋白多克隆抗体的步骤a中，取粒径为80nm和120nm的胶乳微球于MES缓冲液中后，80nm胶乳微球的含量为20g/L，120nm胶乳微球的含量为40g/L。

作为本发明的优选方式之一，所述制备胶乳包被的Ⅳ型胶原蛋白多克隆抗体的步骤a中，采用的MES缓冲液为100mM MES缓冲液。

作为本发明的优选方式之一，所述制备胶乳包被的Ⅳ型胶原蛋白多克隆抗体的步骤a中，采用的EDAC溶液为50g/L的EDAC溶液。

作为本发明的优选方式之一，所述制备胶乳包被的Ⅳ型胶原蛋白多克隆抗体的步骤a中，采用的NHS溶液为50g/L的NHS溶液。

作为本发明的优选方式之一，所述制备胶乳包被的Ⅳ型胶原蛋白多克隆抗体的步骤b中，加入的BSA为30g/L的BSA。

本发明相比现有技术的优点在于：

(1)采用本方法制备的试剂盒具有较高的检测灵敏度和准确度，且使用操作简单、快速，从检测到出结果只需10分钟；