[发明专利]一种保护性人朊蛋白G127I突变体及其构建方法

权利要求书

1.一种人朊蛋白G127I突变体的制备方法，其特征在于，所述人朊蛋白G127I突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，包括以下步骤：

1)获得含有编码人朊蛋白G127I突变体的质粒：以pET30a-hPrP重组质粒为模板，其中pET30a-hPrP重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，设计引物为：

正向引物：5’CCTTGGCATCTACATGCTGGGAAGTGC3’(SEQ ID NO：4)；

反向引物：5’GCACTTCCCAGCATGTAGATGCCAAGG3’(SEQ ID NO：5)；

通过PCR进行定点突变，PCR扩增体系为：

3μl DNA模板；

5μl缓冲液10×PCR Buffer for KOD–Plus-；

5μl 2mM dNTPs；

2μl 25mM MgSO₄；

1μl正向引物；

1μl反向引物；

1μl酶KOD-Plus-；

ddH₂O补齐至50μl；

PCR反应程序为：

S1:94℃,5min；

S2:98℃,10s；

S3:59℃,30s；

S4:68℃,1min/kb；

重复S2至S4 28次；

PCR产物以DpnI酶消化模板，反应体系如下：2μl 10×Tango buffer，1.5μl DpnI酶，PCR产物补齐至20μl，混匀，37℃孵育1h；取5μl消化产物加入50μl DH5α感受态中，混匀，冰浴30min；42℃水浴热击90s，立刻冰浴3min，然后加入LB培养基至1ml并置于37℃220rpm摇床中培养1h；转化产物涂布于100mg/L卡那霉素的LB培养基平板，置于37℃过夜培养；从平板上挑选单克隆菌落于LB培养基中，37℃220rpm摇床中培养8h，将每个单克隆菌落分为两份，一份用于测序，另一份加入终浓度20％甘油保存于-80℃；比对测序结果，将正确突变的菌株提取质粒并转化入E.coliBL21 DE3；

通过PCR对朊蛋白第127位氨基酸进行定点突变，编码所述的人朊蛋白G127I突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，获得含有人朊蛋白G127I突变体基因的重组质粒pET30a-hPrP-G127I；

2)表达纯化人朊蛋白G127I突变体：

a、将含有pET30a-hPrP-G127I质粒的BL21菌株接种于含卡那霉素的10ml LB培养基试管中活化，37℃220rpm培养8-10h；

b、将1ml活化的菌液转接入 250ml含卡那霉素的LB培养基中，37℃220rpm扩大培养3-4h，菌液OD≈0.5，加入终浓度1mM IPTG诱导表达，于摇床中37℃220rpm诱导过夜；

c、4℃17000g离心2min收集菌体，弃上清，沉淀在-80℃中冻融一次后，重悬于裂菌缓冲液，所述裂菌缓冲液包含：20mM Tris、150mM NaCl、2mM EDTA、0.1％Triton X-100、2mMPMSF、pH 7.4；200W超声裂菌30min，超声3s间隔3s；4℃17000g离心30min，弃上清；

d、分别用以下缓冲液洗涤包涵体：①20mM Tris,20mM NaCl,0.5％Triton X-100,pH7.4；②20mM Tris,2M NaCl,pH7.4；③20mM Tris,150mM NaCl,2M Urea,pH 7.4；4℃17000g离心15min弃上清，包涵体沉淀重悬于磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液包含：8M Urea,100mMNa₂HPO₄,10mM Tris,1mMβ-巯基乙醇，pH 8.0，4℃溶解过夜；

e、4℃17000g离心1h收集上清，0.45μm滤膜抽滤；使用Ni-Sepharose柱纯化，经过平衡，上样，洗脱等步骤，可以得到初步纯化的重组人朊蛋白突变体G127I，洗脱液为步骤d)的磷酸缓冲液调pH至4.5以下；

f、根据朊蛋白突变体G127I的摩尔消光系数计算Ni-Sepharose柱纯化的蛋白质浓度，并以复性缓冲液稀释为0.1-0.3mg/ml，复性缓冲液为0.1M Tris、6M Urea,pH7.5，装入干净的透析袋并在室温下透析复性至少12h；

g、复性好的突变体蛋白经HPLC过C4反向色谱柱进一步纯化分离出正确折叠的重组朊蛋白。