[发明专利]一种从肿瘤细胞上清液中分离外泌体的方法

说明书

本发明公开了一种从肿瘤细胞上清液中分离外泌体的方法，包括如下步骤：当肿瘤细胞生长汇合率达85％‑95％时，收集培养基，获取细胞培养上清液，进行膜过滤后，收集滤液再将滤液超滤离心，收集离心超滤液，按超滤液体积1∶1比例加入10w/v％‑12w/v％聚乙‑醇溶液，并充分混匀后4℃离心，最后所得沉淀即为外泌体。本发明取材方便，易于富集扩增培养；分离过程中采用膜过滤、超滤离心和加入聚乙二醇溶液等手段有效增加外泌体富集，耗时短，成本低。

技术领域

本发明涉及一种用于从生物流体中分离外泌体的方法，具体涉及一种从肿瘤细胞上清液中分离外泌体的方法。

背景技术

外泌体(exosomes)是一种由多种细胞所分泌的、直径为30-140nm的亚细胞囊泡结构，电子显微镜下呈球状或杯状。其源于细胞内的早期胞内体(early endosome)，胞内体向内出芽形成多囊泡胞内体(multivesicular endosome，MVE)，后者与细胞膜融合从而将小囊泡释放到细胞外，形成外泌体。外泌体的组分分析表明，外泌体中包含大量的蛋白质、核酸和脂质等，其中一部分是所有外泌体所共有的普遍性组分，其余则是因外泌体来源组织不同而特有的组分。无论是哪种成分，在外泌体介导的细胞间物质、信息交流的过程中均起到关键作用。研究发现，外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质、RNA和microRNA，并且外泌体能够通过生物屏障，在细胞间传递功能性核酸分子，从而发挥各种生物学功能，如肿瘤细胞源外泌体可通过多种途径参与肿瘤微环境中肿瘤细胞与肿瘤微环境之间相互作用，进而促进肿瘤细胞的生长和转移。故外泌体有望成为一种新型给药途径及基因治疗载体。

肿瘤是目前仅次于心脑血管疾病而影响人类健康的一大杀手，局部的浸润和远距离的转移是恶性肿瘤最重要的特点，并且这也是肿瘤致人死亡的主要原因。大量研究发现，与正常细胞相比，肿瘤细胞释放更多的外泌体来调节肿瘤微环境，逃避免疫系统的杀伤，增强肿瘤细胞的耐药性。近年来，随着对外泌体功能研究的深入，在肿瘤来源的外泌体中发现了一系列在促进肿瘤的浸润和转移过程中起到了关键作用的蛋白质和miRNAs。同时，这一发现也为开发肿瘤诊断与治疗的新方法提供了重要的理论基础。

目前，外泌体的提取主要采用超高速梯度离心法、密度梯度超速离心法、超速离心-免疫磁珠亲和法、以及试剂盒离心柱方法等。超高速离心法采用超高速离心机，价格昂贵，通常采用不低于100,000×g离心5-8h，对耗材的要求高，而且耗时很长。免疫磁珠亲和法可以对提取的外泌体进行特异性标记的纯化，但是由于目前对于不同来源的外泌体的标记蛋白还不明确，所以获得的外泌体产量远低于超速离心的产量，并往往需要多种标记的免疫磁珠进行提取，提高了试剂成本。试剂盒离心柱通常只适用于较小量外泌体的获得，并且成本昂贵。因此，分离得到质量可靠和高富集度的外泌体仍是该研究领域目前的一项重大挑战。

发明内容

本发明的目的在于提供一种更高效、简易、价廉的外泌体提取方法，从而克服绝大多数研究者因实验条件限制而无法提取获得量质俱佳外泌体的状况，该发明能够从肿瘤细胞上清液中获得高纯度、高产量的外泌体，对外泌体在科学研究和临床检测中的推广发挥重要的作用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种从肿瘤细胞上清液中分离外泌体的方法，包括以下步骤：

S1：用完全培养基培养肿瘤细胞，当细胞生长密度达到50％-90％时，换用无外泌体血清的培养基，培养24h-48h后，收集细胞上清液，0℃-4℃条件下，依次500-1000×g和1500-2500×g各离心15min以去除细胞或细胞碎片，收集上清液；

S2：将所得的上清液用无菌过滤器过滤，收集滤液，在0℃-4℃条件下，将所得滤液2000-4000×g离心15min，收集上清液；

S3：将步骤S2得到的上清液转移至超滤离心管，在0℃-4℃条件下，3000-5000×g离心30min，收集超滤液；