[发明专利]一种用动物组织提取蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明属于提取蛋白技术领域，具体涉及一种用动物组织提取蛋白的方法。

背景技术

目前在临床中使用较多的注射用填充材料有透明质酸、胶原蛋白等，然而它们具有易于被吸收，生物活性差等缺陷；细胞外基质是由动物细胞合成并分泌到细胞外，分布在细胞表面或细胞间的大分子，主要是一些多糖和蛋白或蛋白聚糖；细胞外基质不仅为细胞提供了一个支持结构和附着位点，而且通过与细胞的粘附分子、生长调节因子、结合蛋白、蛋白水解酶以及酶抑制剂相互作用，而对细胞的粘附、迁移、增殖、分化以及基因表达的调控发挥重要的调节作用；由于细胞外基质具有以上生物活性作用，具有与天然组织器官相似的三维空间结构，其作为支架材料被广泛应用于组织工程中；目前已被成功提取细胞外基质的组织器官包括小肠粘膜、心脏瓣膜、血管、皮肤、神经、骨骼肌、胎盘、膀胱和肝脏；组织的来源广，可以从组织中提取到丰富的细胞外基质和抗菌肽，进而提取出层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白等动物蛋白，研究证明外基质作为生物材料能够促进多种组织再生。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述技术方面的不足，而研制出一种工业化生产、工艺流程简单和生产材料来源广泛的用动物组织提取蛋白的方法。

本发明的目的是这样实现的：一种用动物组织提取蛋白的方法，包括如下步骤：（1）将新鲜的动物组织破碎之后用蒸馏水洗涤8-10次，去除血液成分，然后挤压处理成糊状；

（2）将（1）中的组织中加入0.5mol/L的TRIS-HCl pH7.6、1%脱氧胆酸钠和0.5g/mlPMSF以及加入细球菌酸酶，混合后搅拌1小时；

（3）将（2）得到的混合物离心操作30min，分离上清和沉淀物；

（4）将（3）中加入0.5mol/L的TRIS-HCl pH7.6、0.5g/mlPMSF洗涤二次，再离心操作30min，放弃上清，得到组织细胞外基质混合物；

（5）将（4）得到的混合物加入NaCl后搅拌提取；

（6）将（5）的混合物离心操作1小时，放弃沉淀后得到层粘连蛋白；

（7）将（5）的混合物加入2mol/L的氨基己酸和脲，离心操作1小时，放弃沉淀，得到纤连蛋白；

（8）将（5）的混合物加入0.5mol/L的TRIS-HCl pH7.6，搅拌后静置，待分离后，放弃上清液，取出沉淀结晶后，即为胶原蛋白；

（9）将（3）中得到的上清稀释后通过离子交换柱，加入25mmol/L乙酸铵洗去非阳离子成分，加入10%乙酸洗脱阳离子成分，收集洗脱峰，用0.01%乙酸重悬，得到动物源抗菌肽。

所述离心操作中采用的是冷冻高速离心机。

本发明的有益效果：本发明的优点是利用来源广泛的组织来提取层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白和抗菌肽，此方法可用于工业大批量生产，解决了有些方法只能在实验室成功的问题，为蛋白的提取提供了广泛的技术支持；因此，本发明的优点是工业化生产、工艺流程简单和生产材料来源广泛。

具体实施方式

实施例1

一种用动物组织提取蛋白的方法，包括如下步骤：（1）将新鲜的动物组织破碎之后用蒸馏水洗涤8-10次，去除血液成分，然后挤压处理成糊状；

（2）将（1）中的组织中加入0.5mol/L的TRIS-HCl pH7.6、1%脱氧胆酸钠和0.5g/mlPMSF以及加入细球菌酸酶，混合后搅拌1小时；

（3）将（2）得到的混合物离心操作30min，分离上清和沉淀物；

（4）将（3）中加入0.5mol/L的TRIS-HCl pH7.6、0.5g/mlPMSF洗涤二次，再离心操作30min，放弃上清，得到组织细胞外基质混合物；

（5）将（4）得到的混合物加入NaCl后搅拌提取；

（6）将（5）的混合物离心操作1小时，放弃沉淀后得到层粘连蛋白；

（7）将（5）的混合物加入2mol/L的氨基己酸和脲，离心操作1小时，放弃沉淀，得到纤连蛋白；

（8）将（5）的混合物加入0.5mol/L的TRIS-HCl pH7.6，搅拌后静置，待分离后，放弃上清液，取出沉淀结晶后，即为胶原蛋白；

（9）将（3）中得到的上清稀释后通过离子交换柱，加入25mmol/L乙酸铵洗去非阳离子成分，加入10%乙酸洗脱阳离子成分，收集洗脱峰，用0.01%乙酸重悬，得到动物源抗菌肽。