[发明专利]多种抗体标记的SERS探针和基底及其制备方法和应用

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，具体为多种抗体标记的SERS探针和基底及其制备方法和应用。本发明采用采用多巴胺在自聚合条件下包埋结合多种抗体，得到聚多巴胺和抗体修饰的SERS基底和SERS标记探针，通过免疫结合作用力，利用拉曼光谱技术实现了胰腺癌细胞提取的外泌体以及临床胰腺癌病人的血清样本的高灵敏度检测和诊断，统计学数据分析发现基于MIF抗体的SERS平台能够实现胰腺癌的肿瘤分期判断。本发明中的SERS探针标记方法简单方便，用于胰腺癌外泌体的检测，快速灵敏，特异性高，所需样本量少，无需高速离心的分离过程，能适用于临床诊断和肿瘤分期转移判断。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及多种抗体标记的SERS探针和基底及其制备方法和应用。

背景技术

胰腺癌是预后最差的消化道恶性肿瘤之一，国家肿瘤中心对2015年全国肿瘤登记中心收集的全国各登记处上报的2012年恶性肿瘤登记资料进行分析估计，其中胰腺癌的发病例数为8.6万，发病率为6.35/10⁵，在所有恶性肿瘤发生率中排第10位，其死亡例数达7.7万，死亡率为5.72/10⁵，位居第6位。胰腺癌缺乏特异的临床表现和敏感的早期诊断指标，其诊断和随访常用的血清标志物是CA19-9，但诊断特异性差。目前胰腺癌术前的诊断和分期主要依赖于影像学包括螺旋CT增强扫描和磁共振成像（MRI）的表现，进行原发肿瘤大小（T）、N-区域淋巴结（N）、M-远处转移(M)的分期（TNM）判断。CT扫描时间短，成像速度快，价格便宜，但是辐射量大，不能作为常规的检查方法。 MRI软组织分辨率高，能显示细节，无辐射，但是检查时间长，扫描范围的限制难以对远处转移进行评估，但最终确诊仍需病理学检查。所以目前急需开发一些快速、灵敏、特异性高、无创伤、价格适宜的胰腺癌早期诊断和分期判断的新方法和新技术。

随着对肿瘤研究的不断深入，研究者发现肿瘤患者血液中存在少量循环肿瘤细胞（CTC）以及由坏死癌细胞释放的少量循环肿瘤DNA(ctDNA)。通过检测血液中的CTC和ctDNA对患者肿瘤进行诊断与监测的方法被称为液体活检（liquid biopsy）。相对于传统的手术活检和穿刺活检方法，液体活检能够解决临床取样的难点，满足对患者高频检测的需求，并具有相比于穿刺活检副作用小、操作简单、能重复取样、成本低的优点。因此液体活检有望在肿瘤的早期筛查、肿瘤患者的动态监测和个体化用药等精准医疗方面将发挥越来越重要的作用。

外泌体(exosomes)作为人体内一类重要囊泡，也开始受到越来越多的关注。由于肿瘤衍生的外泌体含有肿瘤特异性蛋白质和miRNA，在肿瘤的生长、转移中扮演者重要的角色，可以作为潜在的肿瘤诊断标志物。通过从体液，如血浆、血清和尿液中提取的外泌体，可包含肿瘤相关的信息，更易于实现对肿瘤的早期检测。研究者从胰腺癌病人血清中分离得到的外泌体中发现了一种磷脂酰肌醇聚糖-1（GPC1）糖蛋白，但是在其他良性胰腺疾病及正常人的血液中分离的外泌体中，GPC1的含量非常低。这项检测比传统的ELISA检测糖抗原CA19-9更可靠。这种基于外泌体标志物所建立的非侵入性的胰腺癌诊断方法，可以非常精确地从良性胰腺疾病中诊断出早期癌变。此外，胰腺癌外泌体中 micro RNA-10b的表达也升高。也有研究发现胰腺导管腺癌细胞产生的外泌体对肝转移有促进作用，且迁移抑制因子（MIF）表达显著升高。循环外泌体中的MIF可作为胰腺癌预后判断及肝转移预测的生物标志物。因此，外泌体是肿瘤研究的一个新兴领域，也是继循环肿瘤细胞CTC和ctDNA后又一备受关注的液体活检的肿瘤标志物和治疗及预后的靶点。