[发明专利]牛A型产气荚膜梭菌的亚单位疫苗及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种牛A型产气荚膜梭菌的亚单位疫苗以及制备方法和应用，所述亚单位疫苗包括牛A型产气荚膜梭菌α‑毒素蛋白截短体以及药学上可以接受的佐剂，所述α‑毒素蛋白截短体为α‑毒素蛋白的从氨基酸255位到氨基酸372位的抗原决定簇氨基酸序列。所述亚单位疫苗具有以下优势：1)不存在灭活不彻底导致的安全性问题；2)质量可控，不存在批次间差异；3)生产设备和空间要求较低，表达量高，成本低；4)不存在散毒的风险，生产操作人员的安全有保障。

技术领域

本发明涉及牛A型产气荚膜梭菌亚单位疫苗的制备和应用，属于兽用生物制品技术领域。

背景技术

A型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是自然界和动物肠道中的厌氧的能产芽孢并且耐热的条件致病菌。该病导致的牛肠毒血症和牛猝死症等均具有发病急、病程短、死亡率高等特点。所以药物往往起不到好的治疗效果。

A型产气荚膜梭菌主要产生α-毒素，该毒素是主要的免疫原，能够刺激机体产生中和性抗体。因此，α-毒素是亚单位疫苗设计的主要靶抗原。但α-毒素具有磷脂酶C活性，能将细胞膜的磷脂酰胆碱水解，细胞膜完整性受到破坏，最终导致细胞破裂死亡，因此其具有细胞毒性、溶血性、致死性和皮肤坏死性等特性。因此，设计表达α-毒素时须考虑将磷脂酶C活性失活。

目前，有将α-毒素进行截短表达，以获得不含毒性但保留免疫原性的α-毒素截短体(具体参见公开号为CN93107585的发明专利)；有将表达出来的α-毒素进行灭活处理，以获得丧失毒性的α-毒素(具体参见公开号为CN200680021810的发明专利)。但是，由于当时技术条件的限制，截短表达时截短位置或长或短，这不仅可能会影响目的蛋白的免疫原性，也可能会降低目的蛋白的产量，导致生产成本较高；另外将野生型的α-毒素进行灭活可能存在灭活不彻底而带来的毒性，也增加了生产工艺的步骤和时间，会导致生产成本的升高，影响疫苗的生产销售。

发明内容

本发明要解决的技术问题一是提供一种可大规模工业化生产的牛A型产气荚膜梭菌亚单位疫苗及其制备方法；二是克服现有技术中截短位置或长或短可能带来的缺陷；三是克服现有技术中对α-毒素进行灭活时可能存在的缺陷。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种牛A型产气荚膜梭菌亚单位疫苗，所述亚单位疫苗包括牛A型产气荚膜梭菌的α-毒素蛋白截短体以及药学上可以接受的佐剂，所述α-毒素蛋白截短体为α-毒素蛋白的从氨基酸255位到氨基酸372位的抗原决定簇氨基酸序列

本发明的技术方案中，优选地，所述α-毒素蛋白截短体的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。

本发明的技术方案中，优选地，所述药学上可以接受的佐剂为ISA 201VG佐剂，所述α-毒素蛋白截短体与佐剂的重量比为1:1。

本发明的技术方案中，优选地，所述亚单位疫苗中每头份含有30～200μgα-毒素蛋白截短体。

本发明的技术方案中，优选地，所述亚单位疫苗中每头份含有100μgα-毒素蛋白截短体。

根据本发明另一个方面，本发明还提供了一种制备α-毒素蛋白截短体的方法，所述方法包括以下步骤：1)将α-毒素蛋白的核苷酸序列进行密码子优化，得到密码子优化后的α毒素蛋白核苷酸序列，将密码子优化后的α毒素蛋白核苷酸序列通过PCR扩增出α-毒素蛋白截短体的核苷酸序列；2)将α-毒素蛋白截短体的核苷酸序列插入到pET28a载体中，得到重组载体；3)将重组载体转入转化E.coli BL21(DE3)，诱导表达、纯化后获得α-毒素蛋白截短体。

本发明的技术方案中，优选地，所述密码子优化后PCR扩增出的α-毒素蛋白截短体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明另一个方面，本发明还提供了一种亚单位疫苗在牛A型产气荚膜梭菌治疗和预防中的应用。