[发明专利]一种细胞外泌体的提取方法

说明书

本发明公开了一种细胞外泌体的提取方法，包括以下步骤：（1）上清液分离：将细胞培养后的培养基，离心去除杂质，分离出培养上清液；（2）一次提取：将步骤（1）所述培养上清液与外泌体提取液混合后进行孵育，孵育后得第一孵化液，对第一孵化液进行离心浓缩，得到含外泌体的浓缩液；（3）二次提取：将步骤（2）所述含外泌体的浓缩液加入无菌PBS溶解后加入外泌体提取液进行孵育，孵育后得第二孵化液，将第二孵化液进行离心收集底部沉淀，得细胞外泌体。本发明有效地提高细胞外泌体的纯度，降低其杂蛋白含量。

技术领域

本发明属于生物技术领域,具体涉及一种细胞外泌体的提取方法。

背景技术

细胞外泌体是由细胞内多泡体与细胞膜融合后释放到细胞外隙或生物学体液中的膜性囊泡，包含有蛋白质、mRNA 、miRNA和DNA片段等生物活性物质,参与人体许多重要的生理或病例过程，在细胞通讯、细胞迁移、促进组织修复或调节免疫反应等作用，具有广阔的应用前景，获得高纯度的细胞外泌体一直是展开应用研究的前提。

由于外泌体为纳米级囊泡结构，现有技术大部分采用外泌体提取试剂盒对其进行脱水处理后，高速离心得到。

上述方法提取出的细胞外泌体杂蛋白含量特别高，纯度很不纯，对细胞外泌体的后续应用及研究造成很大影响，所以有必要对现有的细胞外泌体提取方法进行改进，以解决细胞外泌体纯度低的问题。

发明内容

本发明针对以现有技术制备的细胞外泌体纯度不高的问题，提供了间充质干细胞外泌体的制备方法。

细胞外泌体的提取方法，其不同之处在于，所述细胞外泌体通过以下步骤制备：

步骤（1）上清液分离，将细胞培养后的培养基，离心去除杂质，分离出培养上清液；

步骤（2）一次提取，将步骤（1）所述培养上清液与外泌体提取液混合后进行孵育，孵育后得第一孵化液，对第一孵化液进行离心浓缩，得到含外泌体的浓缩液；

步骤（3）二次提取，将步骤（2）所述含外泌体的浓缩液加入无菌PBS溶解后加入外泌体提取液进行孵育，孵育后得第二孵化液，将第二孵化液进行离心收集底部沉淀，得细胞外泌体。

上述技术方案中，所述细胞为间充质干细胞。

上述技术方案中，所述细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或外周血间充质干细胞中的一种。

上述技术方案中，所述步骤（1）由以下步骤制备：

步骤1A:将间充质干细胞进行传代培养，从中筛选出细胞状态良好、增殖能力强的间充质干细胞；

步骤1B: 将不含外泌体血清的干细胞ɑ-MEM空白培养基加入步骤1A所述筛选的间充质干细胞中,24小时至48小时后收取细胞培养上清液即为条件培养基；

步骤1C：将步骤1B中所述条件培养基在4℃，2000g条件下离心30min，弃去沉淀杂质，收集上层液体，即培养上清液。

上述技术方案中，所述细胞外泌体制备步骤（2）通过以下步骤完成：

步骤2A：将步骤1C中所述培养上清液与Total exosome Isolation外泌体提取液以体积比为2:1进行混合后，在4℃条件下孵育8小时至12小时，孵育后得到第一孵育液；

步骤2B：将步骤2A所得孵育液在4℃，10000g条件下离心60min,所得肉眼不可见的底部沉淀，即为含外泌体的浓缩液。

上述技术方案中，所述细胞外泌体制备步骤（3）通过以下步骤完成：

步骤3A：将步骤2B中所述含外泌体的浓缩液用磷酸缓冲盐溶液（PBS）进行溶解，得到外泌体盐溶液；