[发明专利]一组荧光蛋白探针及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一组荧光蛋白探针及其制备方法和应用，属于氧化还原的检测探针技术领域。本发明提供了一组荧光蛋白探针，所述荧光蛋白探针为含半胱氨酸对突变的鳗鱼荧光蛋白UnaG。本发明提供的荧光蛋白探针能够实现氧化还原的高特异性、高敏感性检测。

技术领域

本发明涉及氧化还原的检测探针技术领域，尤其涉及一组荧光蛋白探针及其制备方法和应用。

背景技术

活性氧(Reactive oxygen species，ROS)是一类有高活性的含氧化合物。包括过氧化物，超氧化物，羟基自由基，单线态氧等。其可以在细胞内多种细胞器中产生，如线粒体，内质网(特别是内质网应激的情况下)等，还与多种氧化酶和氧合酶相关。ROS对细胞有双重作用。一方面，其导致细胞内脂质体，蛋白和DNA的氧化，并引起有害生物分子的积累。这些损伤和被氧化的生物分子反过来促成了多种病理过程，包括恶性疾病，糖尿病，动脉硬化，缺血再灌注伤害和慢性炎症过程以及很多的神经萎缩性疾病等，且多样的活性氧源产生的氧化损伤系统性积累驱动了衰老的过程。另一方面，也有越来越多的研究表明，ROS可以在特定的信号通路，如代谢调控，天然免疫，干细胞生物学，癌症的发病机制，衰老的发生等过程中发挥一定的功能。为了更好地研究细胞内氧化还原状态与生命调控及疾病发生发展之间的关系，亟需发展高效特异性和敏感性的工具，对细胞内的氧化还原动态变化、亚细胞分布等进行精确检测。

相比于化学小分子荧光探针，基因编码的荧光蛋白探针在精确定位亚细胞结构，消除人为干扰，以及活体应用方面具有很大优势，因此基于荧光蛋白的生物传感器特别适合用于细胞内氧化还原的原位时空特异性监测。目前常用的可用于监测细胞内氧化还原水平的荧光蛋白探针包括：过氧化氢荧光蛋白探针HyPer系列和Orp1-roGFP2，巯基类氧化还原荧光蛋白探针rxYFP、roGFP家族、rxRFP以及Grx1-roGFP2等。

鳗鱼肌肉蛋白UnaG是近期在日本河鳗中发现的一种有高荧光强度的蛋白。UnaG属于脂肪酸结合蛋白家族，其在河鳗中的表达受到小直径肌纤维的限制。相比于GFP及其相关的蛋白，UnaG不依赖于分子氧来实现达到荧光状态。UnaG不能自主发挥功能，需要结合一个辅因子即胆红素Bilirubin来迅速的产生其独特的绿色荧光。Bilirubin是一种可跨膜的亚铁血红素代谢物，也是一种临床健康的生物标志。对于酵母等不能天然产生Bilirubin的微生物，UnaG的发光机制让其成为临床诊断和基本研究中的一种有高度选择性的“开关”荧光探针。

维持细胞内氧化还原状态，对于调控多种生理功能，有重要的意义。而现有的检测氧化还原的工具都有一些不足。化学探针，如Dichlorofluorescein，虽然被广泛的用于检测活细胞中的活性氧，但其受到人为干扰、体内应用、亚细胞定位等因素的限制。而前面提到的氧化还原荧光蛋白探针，如rxYFP，roGFP，HyPer等，虽然可以应用于活细胞和亚细胞水平的检测，但这些探针都基于水母荧光蛋白GFP家族，在缺氧的情况下，无法正确成熟和荧光生成，影响了其在肿瘤、组织缺血再灌注等乏氧条件下的应用。此外，基于水母荧光蛋白GFP家族发展的大部分探针易受pH波动的影响，为氧化还原状态的精准解析带来很大困难。

UnaG的荧光生成不依赖于氧气、且不受pH波动的影响，很好的克服了以上缺陷。但UnaG荧光蛋白本身对氧化还原是不敏感的，即UnaG不会受环境中的氧化还原状态波动而导致荧光强度的变化，这限制了UnaG在不同生物环境中对氧化还原状态的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一组荧光蛋白探针及其制备方法和应用。本发明提供的荧光蛋白探针能够实现氧化还原的高特异性、高敏感性检测。

本发明提供了一组荧光蛋白探针，所述荧光蛋白探针为含半胱氨酸对突变的鳗鱼荧光蛋白UnaG。

优选的是，所述鳗鱼荧光蛋白UnaG的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的是，所述突变的半胱氨酸对的数量至少为1对。