[发明专利]一种大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置和方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学检验领域核酸检测领域，特别涉及一种能够实现大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置和方法。

背景技术

在肿瘤早期诊断筛查、血液病毒分型及载量分析、无创产前诊断等领域，都需要对超低浓度的核酸进行高速高灵敏度高特异性的检测，常规的PCR已越来越无法满足需求。为实现此功能，人们在PCR基础上，发展了一种数字PCR技术，将检测灵敏度提高了1～2个数量级。

微滴式数字PCR采用的“分而治之”(divide and conquer)的检测策略，将样品、PCR试剂混合物作为分散相，将油作为连续相，利用微流控技术，将样品混合物形成一个个液滴悬浮于连续相中。进而，将一个标准PCR扩增分配至大量微滴(纳升至皮升)中，每个微滴中仅包含0个或1个拷贝的目标分子(DNA模板)。对每个微滴进行独立PCR扩增，扩增结束后，检测每个微滴的荧光，对阳性信号的微滴进行计数，从而得到样品模板的绝对拷贝数和核酸浓度。微滴的尺寸和数量决定了数字PCR的检测灵敏度和下限，现有的数字PCR微滴数在2万～1000万之间。

现有的商用微滴式数字PCR技术操作如下：在专用的微滴制备芯片上制备液滴；通过移液器将微滴转移至离心管中，使用常规的PCR仪进行温度循环扩增；扩增完成后，利用流式技术依次对每个微滴进行荧光激发与探测，计算结果。这样的检测方式存在以下问题：

(1)流式检测速度较慢，检测速度在200～500个/s，检测过程耗时久，通量低；

(2)只能对单个微滴进行终点法检测,不能实时qPCR，降低了特异性和灵敏度；

(3)光路硬件复杂，难以实现多重数字PCR检测(4重以上)；

(4)两次液滴的转移过程将导致微滴损失，以及可能引来的外界污染；

(5)常规PCR扩增仪的加热块热惯量大，热循环时间长(2小时左右)。

为解决上述五个问题，申请人已提出了一体式数字PCR芯片，并已申请发明专利(申请号201510961967.0)。参见附图1，一体式数字PCR芯片包括本体1，位于其上的连续相注入孔11、样品注入孔12、单层微滴平铺腔体15、真空接入孔16、用于生成微滴的“+字型”微结构13，以及用于连接连续相注入孔11和“+字型”微结构13的液路14、用于连接样品注入孔12和“+字型”微结构13的第一液路17、用于连接“+字型”微结构13和单层微滴平铺腔体15的第二液路18。通过MEMS工艺将所述所有微结构制作于一片聚合物基板上，随后与另一块聚合物平板相键合而形成封闭的微流道系统，在连续相注入孔11、样品注入孔12、真空接入孔16三处开孔，用于注入样品和施加负压。

参照图2，其基本原理为：在连续相注入孔11注入油、样品注入孔12注入样品后，在真空接入孔16施加真空负压，样品、连续相将在负压的作用下，通过流道14和17到达“+字型”微结构13。在此处，样品将因连续相的剪切而形成一个个纳升级微滴20，随后经过流道18进入单层微滴平铺腔体15，平铺成微滴单层19。

该技术方法具有以下优势：微滴单层19适用于使用CCD进行图像化荧光拍照检测，具有较高的通量和速度；通过连续荧光图像检测可以获得微滴荧光随循环此时的变化曲线，进行单液滴qPCR检测，具有较高灵敏度和特异性；通过增加激发光源和滤光片，可轻易实现多重数字PCR；整个过程一体化完成，不存在微滴损失和外界的污染。最后，单层微滴将具有较大的温控面积和较小的热惯量，可以将PCR循环扩增时间降低至半小时以内。

为了利用该数字PCR芯片进行核酸检测，一方面需要对该数字PCR微流控芯片进行温度循环扩增，另一方面需要对数字PCR液滴单层进行实时激光激发和荧光成像探测。每温度循环一次，便进行一次液滴荧光图像检测，以获得每个液滴的荧光连续变化曲线。为提高通量，在一块芯片上，可集成多个一体式数字PCR微流控结构，形成32个、48个甚至96个样品的同时检测(参照图3)，以便提高通量，这样便需要芯片可以进行一维或二维的运动，以便可以通过扫描方式进行大面积图像采集。另外，为提高检测效率，采用一种新算法，先通过小倍率进行粗略大视场观看，发现可能存在液滴荧光点后，切换成高倍率精细小视场观测的方式，以提高效率。但现有的检测装置如荧光显微镜等，无法满足上述检测要求。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。