[发明专利]TRIM31抑制剂磁性靶向载药微球在制备抑制PDAC增殖能力药物中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及药学领域，尤其是一种TRIM31抑制剂磁性靶向载药微球在制备抑制PDAC增殖能力药物中的应用。

背景技术

胰腺导管腺癌是一种高度恶性的消化道肿瘤,近年来在全球的发病率呈逐年上升趋势,而死亡率一直居高不下，5年生存率仅为3％-6％。胰腺导管腺癌预后差,归因于临床症状出现较晚,大多数患者一经诊断即失去手术机会，而胰腺导管腺癌患者能够获得较长生存率的唯一的机会便是能够进行根治性手术切除。因此早期精确的诊断以及新型的治疗手段对胰腺导管腺癌的诊治尤其重要。

三结构域蛋白(tripartite motif-containing protein，TRIM)家族是细胞生物学功能的关键调节因子，TRIM家族成员含有多域的E3泛素连接酶，并以N端存在三结构域为特征。研究表明TRIM家族在细胞生长、免疫、抗病毒等方面的功能显著。目前，TRIM蛋白家族成员TRIM 3、TRIM 25和TRIM 37等在恶性肿瘤中的作用也逐渐被证实。目前关于TRIM31的研究较少，其在肿瘤发生与进展中的作用尚不明确，其在胰腺导管腺癌中的作用尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是：提供一种TRIM31抑制剂磁性靶向载药微球在制备抑制PDAC增殖能力药物中的应用，它对胰腺导管腺癌增殖能力具有显著的抑制作用。

本发明是这样实现的：TRIM31抑制剂磁性靶向载药微球在制备抑制PDAC增殖能力药物中的应用。

TRIM31抑制剂磁性靶向载药微球作为唯一有效成分。

将TRIM31抑制剂磁性靶向载药微球与药学上可接受的辅料制备成药学上可接受的剂型。

为了验证本发明的实验效果，进行了以下体内实验：

1 材料与方法

1.2.1 细胞培养：正常胰腺导管上皮细胞HPDE、胰腺导管腺癌细胞AsPC-1、BxPC-3用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基，MIAPaCa-2及Panc-1用含10％胎牛血清的RPMI DMEM培养基，两组细胞均置于37℃、5％CO₂的恒温培养箱中培养。

1.2.2 RT-qPCR和Western blot法检测各细胞系中TRIM31表达量取适量处于对数生长期的各细胞，提取细胞总及蛋白。选取吸光度度1.8-2.0(A260/A280)之间的RNA样本用于实验。再根据逆转录试剂盒说明书，以GAPDH作为内参，分别逆转录为cDNA。以GAPDH作为内参，qRT-PCR反应检测TRIM31在各细胞系中的相对表达量。Western blot法检测各细胞系的TRIM31蛋白相对表达量。

1.2.3 沉默TRIM31及沉默效率检测：选取两株胰腺导管腺癌细胞进行后续实验，将两株细胞分别分为TRIM31沉默组(实验组)和空载体组(阴性对照组)。取2×10⁵个对数生长期细胞分别接种于6孔板中，待细胞贴壁后利用lipofectamine3000将3条siRNA-TRIM31片段及对照siRNAs分别转染两株细胞。48h后收集细胞，提取RNA；72h后收集细胞，提取蛋白。通过RT-qPCR和Western blot检测siRNA对TRIM31的沉默效率。

1.2.4 检测细胞增殖采用CCK8法，转染siRNA48h后收集细胞，以3×10³个/孔细胞接种于96孔板中，每组分别设0、1、2、3及4d组，每个时间点设置5个复孔；检测前每孔分别加入CCK8试剂10uL，避光37℃孵育2h，轻轻振荡后，酶标仪450nm波长处测定光密度(OD)值，观察TRIM31对胰腺癌细胞增殖的影响。

1.2.5 人胰腺癌细胞单克隆形成能力采用细胞平板克隆实验，转染siRNA 24h后收集细胞以5×10³个/孔细胞接种于6cm中，37℃培养箱中培养7-8天后，4％多聚甲醛固定30分钟，0.1％结晶紫染色30分钟，计数每孔克隆形成数量并拍照记录。

1.3 统计学处理：数据用SPSS 22.0统计软件处理，计数资料以(x±s)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TRIM31在胰腺导管腺癌中的表达