[发明专利]一种硼酸修饰的纳米复合材料的糖肽富集与质谱检测方法

说明书

技术领域

本发明属于先进纳米材料与纳米技术领域，具体涉及一种硼酸修饰的纳米复合材料的糖肽富集与质谱检测方法，尤其涉及一种硼酸修饰的金属有机骨架（MOF）的糖肽富集与MALDI-TOF MS以及LC-MS/MS检测的方法。

背景技术

蛋白质的糖基化是生命过程中重要且普遍的翻译后修饰，它们与细胞间信号传递、细胞分裂、增殖、分化和相互作用等许多重要的复杂生物过程息息相关。一些研究表明，糖肽的表达水平异常，可作为很多疾病的生物标志，尤其是癌症等人类重大疾病。所以对糖肽的研究对疾病的早期诊断有着重要的意义。然而糖肽的丰度往往非常低，并且它们质谱响应会受到高丰度非糖肽和蛋白质的压制，样品中的盐分和表面活性剂同样也会对其质谱行为产生干扰，使得其电离效率非常低，质谱检测相对较为困难。因此在使用质谱方法分析复杂生物样品中的糖肽之前，对样品中的肽段进行选择性富集是十分必要的。

自19世纪80年代以来，一系列新的软电离技术如快原子轰击电离、基质辅助激光解吸电离、电喷雾电离等发现后，生物质谱技术迅速发展。由于质谱技术（Mass Spectrometry，MS）具有高准确性、高灵敏度和自动化操作的特点，并且它能够准确测量肽段和蛋白质的相对分子量和磺酸基酸序列等，快速、精确地获得多种蛋白质属性参数，结合生物信息学工具，可迅速进行蛋白质的鉴定，从而为蛋白质的结构解析提供可靠依据。因此质谱技术无可争议地成为当前蛋白质组学研究中不可或缺的平台，质谱数据的信息质量直接决定了蛋白质鉴定的可靠性和鉴定数量。

随着近年来研究的不断深入，许多方法都被用来选择性分离富集糖基化蛋白和多肽，比如硼酸亲和色谱、肼化学、亲水相互作用色谱（HILIC）、色谱分析法、体积排阻法等。其中硼酸方法在糖肽富集方面引起了广泛的重视。

金属-有机骨架材料是指由有机官能团为支架、金属离子或金属簇为中心节点，通过自组装形成的具有规则纳米孔道的三维周期性的网格结构多孔材料。具有非常大的比表面积、稳定的纳米级孔道、可调控的孔道结构、良好的热稳定性等优异性能，且不饱和的配位金属可能与含有羧基、磺酸基等官能团的被分析物质发生配位作用，MOFs材料已成为有机化学、无机化学、物理化学领域的研究热点。MOFs如今在气体分离、苯及其同系物的选择性吸附、药物研发等发挥了其不小的作用。近年来，MOFs材料已初步应用于蛋白质/肽的分离富集，并显示MOFs材料在蛋白质组研究中，如低丰度肽富集等有很好的潜力。

因此，需要设计一种新型的硼酸修饰的纳米复合材料的用于糖肽富集与质谱检测。

发明内容

本发明目的在于提供一种硼酸修饰的纳米复合材料的糖肽富集与质谱检测方法。

本发明提供的一种硼酸修饰的纳米复合材料的糖肽富集与质谱检测方法，具体步骤如下：将硼酸修饰的纳米复合材料以超纯水为溶剂配置成10 mg/mL的材料分散液；将该材料分散液与目标糖肽溶液加入50 mM碳酸氢铵缓冲液中，混合并在37°C下震荡富集45分钟；离心分离出纳米复合材料，用50 mM碳酸氢铵缓冲液充分洗涤，随后用50%乙腈/1%三氟乙酸洗脱；洗脱液用质谱分析；

其中，所述的硼酸修饰的纳米复合材料为硼酸修饰的金属有机骨架纳米复合材料。

本发明中，质谱分析为MALDI-TOF MS质谱分析，具体步骤为：取1 μL洗脱液点到MALDI-TOF MS进样靶板上，干燥后再点加1 μL浓度为30 mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸溶液于该液滴上，形成基质结晶，干燥后进行MALDI-TOF MS质谱分析。

本发明中，质谱分析为LC-MSMS质谱分析，具体步骤为：将洗脱液冻干后分散在10 μL A相中，4 μL分散液根据线性梯度在110分钟内从2% B相到40% B相进行LC-MSMS质谱分析，其中，A相为水/0.1%甲酸，B相为乙腈/0.1%甲酸。

本发明中，所述的硼酸修饰的金属有机骨架纳米复合材料具体制备步骤如下：

（1）将FeCl₃•6H₂O、柠檬酸钠、乙酸铵溶于乙二醇中，磁力搅拌至澄清，超声后转移至反应釜，200℃下反应16小时，取出反应釜，冷却过夜，倒出磁球，用去离子水及乙醇充分洗涤，在50℃下真空干燥得到四氧化三铁磁球；

（2）配置聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯亚胺的水溶液，将步骤（1）所得的四氧化三铁磁球分散于该水溶液中，室温下搅拌反应6-20小时，制得聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯亚胺包覆的磁球，磁铁分离产物，用二甲基甲酰胺和水充分洗涤，在50℃下真空干燥；