[发明专利]一种检测氯氰菊酯的时间分辨荧光试纸条及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测氯氰菊酯的时间分辨荧光试纸条及其应用，属于时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术领域，用于苹果、玉米、黄瓜、西红柿、菠菜、白菜等样品中氯氰菊酯的含量检测。

背景技术

氯氰菊酯，又名兴棉宝、灭百可、赛波凯，是一种合成的除虫菊精类，对于昆虫是一种速效神经毒素。氯氰菊酯的工业品为黄色至棕色粘稠固体，60℃时为粘稠液体。动物急性中毒表现为共济失调，步态不稳，偶有震颤，同时具有慢性毒性，对皮肤粘膜亦有刺激作用。随着该农药的应用日益广泛，必然会造成对蔬菜及其他作物的污染。因此，我国相关质检部门对该物质进行了限量规定。GB 2763-2016《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》规定了氯氰菊酯的最大残留限量：谷物(部分)0.3mg/kg，大豆和玉米0.05mg/kg，蔬菜中菠菜、普通白菜、莴苣和大白菜均为2mg/kg，水果中橙、柠檬、柚、苹果、梨、核果类(桃除外)和枸杞均为2mg/kg，柑橘、桃和榴莲均为1mg/kg。

目前，检测氯氰菊酯的方法有气相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法等。仪器检测方法的精确度较高，但是仪器昂贵，需要专业的技术人员，检测步骤复杂，难以批量检测样品，不适用于基层实验室批量、快速检测样品。而免疫学检测方法操作简单、快速、灵敏，可同时检测多数样品，是理想的快速筛选手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏度高、操作简单、成本低、检测时间短的氯氰菊酯时间分辨荧光试纸条。

本发明所提供了一种氯氰菊酯时间分辨荧光试纸条，该试纸条包括样品吸收垫、反应膜以及吸水垫三部分。反应膜位于中间，样品吸收垫与吸水垫分别搭接于反应膜左右两端。其中，样品吸收垫上设有加样区和微球区，微球区上载有时间分辨荧光微球；反应膜上设有检测线(T线)和质控线(C线)，T线接上包被氯氰菊酯抗原，C线包被抗兔抗体。

所述氯氰菊酯时间分辨荧光微球，包括检测微球和质控微球，检测微球为表面包被有氯氰菊酯单克隆抗体的荧光微球，质控微球为表面包被有兔抗标记蛋白的荧光微球。

所述荧光微球中填充了斓系元素化合物；较优的，该斓系元索鳌合物为铕鳌合物；最优的，该铕鳌合物可为Eu(TTA)3/TOPO或Eu(TTA)3/Phen。

所述蛋白可以是牛血清Y-球蛋白(BGG)或小牛血清白蛋白(BSA)。

所述时间分辨荧光微球粒径范围为100-1000nm。

所述硝酸纤维素膜上，T线上包被的抗体为氯氰菊酯抗原，C线上包被的抗兔抗体。

所述氯氰菊酯时间分辨荧光免疫定量检测试纸条底部设有塑料底板。

所述T线接上包被氯氰菊酯抗原是由氯氰菊酯半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。

所述氯氰菊酯单克隆抗体是以氯氰菊酯半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，是由氯氰菊酯单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌获得；所述抗兔抗体是将兔源抗体免疫羊得到。

所述样品吸收垫为Fusion5膜或其他功能相同的膜；所述结合物释放垫可为玻璃棉或聚酯材料；所述吸水垫为吸水垫；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：

(1)质控微球制备：

①用生物素标记蛋白；

②采用上述标记蛋白包被醛基修饰的荧光微球；

(2)半抗原制备：经过一系列化学反应得到氯氰菊酯半抗原产物；

(3)将氯氰菊酯半抗原与载体蛋白偶联，得到氯氰菊酯半抗原-载体蛋白偶联物；

(4)用氯氰菊酯半抗原-载体蛋白偶联物免疫新西兰大白兔，将新西兰大白兔脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到氯氰菊酯单克隆杂交瘤细胞株；

(5)提取新西兰大白兔IgG免疫健康山羊，得到抗兔抗体；

(6)检测微球制备：采用氯氰菊酯的单克隆抗体包被醛基修饰的荧光微球；

(7)空白大卡粘贴：将硝酸纤维素膜粘贴在塑料底板中间，Fusion5膜与吸水垫分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端；

(8)喷膜：将兔抗标记蛋白的荧光微球和氯氰菊酯单克隆抗体的荧光微球采用释放缓冲液混合稀释到一定浓度，喷到Fusion5膜的微球区；氯氰菊酯抗原和抗兔抗体稀释后，分别喷到硝酸纤维素膜的T线和C线位置；

(9)干燥及切条：将上述喷好试剂的大卡烘干、切条。