[发明专利]生产L-色氨酸的菌株及用途

说明书

本发明涉及生产L‑色氨酸的菌株及其在发酵中的用途。具体而言，本发明利用基因工程方法减弱或阻断工程菌(例如大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌)的磷酸戊糖途径的氧化阶段，大幅提高菌株产L‑色氨酸的能力。

技术领域

本发明涉及微生物工程领域。更具体而言，本发明通过对工程细菌的L-色氨酸生物合成 途径进行改进，提高菌株的L-色氨酸产量。

背景技术

色氨酸的化学名称为β-吲哚基丙氨酸。其作为人和动物的必需氨基酸之一，被广泛用于 医疗、制药、食品和饲料工业中。通常可通过化学合成、蛋白水解、酶促转化、直接发酵等 方法生产L-色氨酸。

就发酵方法而言，本领域已报道通过改良发酵工艺本身(例如调整搅拌和氧气供给、优 化培养基组成、实时调控发酵液中的糖浓度或产物浓度等)、或者借助传统的诱变筛选方法 来弱化竞争性通路或降低中间产物反馈抑制，提高氨基酸发酵产量(DE102008040352A1和 CA2663711A1)。然而，对于生物合成路线较长的芳香族氨基酸，由于调控步骤多、调控网 络复杂，可能的关键性节点较多，通过这样的传统方式仅能有限地提高氨基酸的产量(Ikeda M，appl.Microbiol.Biotechnol.2006，69：615-626)。

近二十年发展的遗传工程和代谢工程方法使得能够对细菌自身的氨基酸合成通路进行 定向优化设计，去除通路瓶颈或代谢反馈、调整碳中心代谢途径以增加前体供应量，以及进 一步地增强芳香族氨基酸的转运出胞以减少胞内的产物积累，从而提高发酵产量。

本领域已知的是，在几乎全部的物种中，芳香族氨基酸的生物合成首先是磷酸烯醇式丙 酮酸(PEP)和赤藓糖-4-磷酸(E4P)缩合生成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)， 随后经催化生成分支酸。然后，通过不同的途径生成L-苯丙氨酸、L-酪氨酸或L-色氨酸。基 于此，对L-色氨酸生物合成通路的改造可通过两种方式进行：增强分支酸的碳代谢流以提高 分支酸的产量(即，对芳香族氨基酸共同通路的改造)；以及对由分支酸生成L-色氨酸的色 氨酸合成支路的改造。例如，Ikeda M等在产色氨酸的谷氨酸棒状杆菌中过表达tktA，增加 E4P的供应量(Ikead M，production of tryptophan by CorynebacteriumGlutamicum with the modified pentose phosphate pathway，1999)。Berry A提出在大肠杆菌中过表达去除反馈抑制 的aroG和TrpEDCBA基因，使得葡萄糖的糖酸转化率超过22％(Berry A，Improving production of aromatic compounds in Escherichia coliby metabolic engineering，1996)。

需要指出的是，L-色氨酸合成的关键前体PEP、E4P、L-丝氨酸、L-谷氨酰胺以及5-磷 酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)等分别来自不同的代谢通路：PEP和L-丝氨酸来自糖酵解(EMP)途径，而E4P和PRPP来自于磷酸戊糖(PPP，也称为HMP)途径。因此，对于L-色氨酸的 调控不但需要增强这些来自不同代谢流的前体的产量，还需要进行流平衡(CN104388330A)。 考虑到合成途径较长且调控复杂，目前所报道的L-色氨酸的发酵产量仍远低于非芳香族氨 基酸：发酵罐中L-色氨酸的糖酸转化率估计为20-23％，L-苯丙氨酸约为25％；而其他氨基 酸则均可实现相对高的产量：L-赖氨酸(盐酸盐)的糖酸转化率为40-50％，L-谷氨酸为45-55％，L-精氨酸为30-40％，L-苏氨酸为40-50％，L-缬氨酸为30-40％，L-丙氨酸为45-55％(Ikeda M，2006)。

就这一点而言，目前仍存在对L-色氨酸的合成通路进行进一步优化的需求。

发明内容

本发明提出可通过降低磷酸戊糖途径氧化阶段中的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的表达水平和/ 或活性，来减弱或阻断L-色氨酸发酵菌株中磷酸戊糖途径的氧化阶段，减少由于脱羧造成的 碳损失，增加碳中心代谢流，从而提高L-色氨酸发酵产量。