[发明专利]一种猪附红细胞体病快速镜检诊断试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域：

本发明属于兽医学检验领域，具体涉及一种猪附红细胞体病快速镜检诊断试剂盒及其制备方法。

背景技术：

附红细胞体病是附红细胞体寄生在人或多种动物的红细胞表面、血浆和骨髓而引起的一种人畜共患病。过去国际上将附红细胞体列为立克次氏体，但是近年来根据16SrRNA基因序列分析，附红细胞体在分类上更接近于支原体属(Mycoplasma)。猪附红细胞体(Eperythrozoonsuis，E.suis)是一种寄生于猪红细胞表面或游离于血浆的病原体，可引起新生仔猪和断奶仔猪虚弱和贫血，肥育猪生长缓慢，母猪繁殖障碍、受胎率低、不发情、流产和死胎等综合性症状，严重威胁着畜牧业的发展和人类健康。目前已经造成了巨大的经济损失，并呈范围扩大趋势，因而引起国内外学者的广泛关注。

临床上该病的诊断方法主要以直接镜检为主，其中包括鲜血压片和涂片，但是假阳性率高。动物实验方法是确诊的有效手段，但费时间太长，费用高。血清学方法包括间接血凝试验(IHA)、补体结合试验(CFT)或酶联免疫吸附试验(ELISA)等，由于附红细胞体病的抗体变化起伏较大，这些方法也不适用于该病诊断。PCR诊断方法有很强的特异性，但技术要求较高，检测操作影响因素较多。

发明内容：

本发明为了解决上述问题，提供了一种猪附红细胞体病快速镜检诊断试剂盒及其制备方法，该试剂盒配套科学合理，检测方法简单，检测准确率高达98％，与猪附红细胞体病PCR诊断试剂盒准确率相当。

具体地，本发明提供了一种猪附红细胞体病快速镜检诊断试剂盒，由检测试剂、器皿器械组成，所述的试剂由瑞氏染料、姬姆萨染料、甘油、吐温-20、甲醇组成，所述的器皿器械由试剂瓶、胶头滴管组成。

上述所述的试剂纯度均要求为优级纯。

本发明还提供了一种猪附红细胞体病快速镜检诊断试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1、快速镜试剂盒器皿器械的洗涤：

1.1将所需玻璃器皿放入装有强酸氧化清洗剂的玻璃器皿缸中浸泡过夜；

1.2取出经强酸氧化清洗剂浸泡过夜的玻璃器，用热肥皂液进行清洗，反复用自来水冲洗5次，用蒸馏水浸泡1小时取出玻璃器皿自然滤干。

1.3将玻璃器皿放入干燥消毒箱138℃干热消毒1小时，冷却后取出放入35℃恒温干燥箱备用。

1.4滴管头、塑料试剂瓶瓶的洗涤：将滴管头和塑料瓶放入清水中浸泡30分钟；将清水中浸泡过的滴管头和塑料瓶用热肥皂液进行清洗，反复用自来水冲洗5次，用蒸馏水浸泡1小时，取出滴管头和塑料瓶自然滤干。

1.5将滴管头和塑料瓶放入高压消毒锅15磅消毒30分钟，冷却后取出放入35℃恒温干燥箱干燥备用。

2、快速镜试剂盒试剂的配制：

2.1瑞氏染料和姬姆萨染料称量前事先放入30-40℃温箱干燥箱过夜；

2.2分别称取：瑞氏染料粉1-1.8g、姬姆萨染料1-1.8g。

2.3分别量取：甘油20-36ml、吐温-20 4-8ml、甲醇1000ml。

2.4将称取的瑞氏染料和姬姆萨染料放置乳钵内，用乳棒轻轻敲碎染料成粉末，再行研磨至细粉末；

2.5在乳钵内加入甘油溶解染料，使染料在乳缽内显现镜面光泽，而无染料粉粒附着，加适量甲醇进行研磨，静置片刻，将上层液体倒入一清洁的2000ml容量瓶中；

2.6再加入甲醇研磨，重复数次，直至乳钵内无染料为止；

2.7在容量瓶中加入吐温-20，用甲醇定容于2000ml；摇匀并密封瓶口，存室温暗处24小时后过滤一次，2周后再过滤一次，即可使用；染色液储存愈久，则染料溶解、分解越充分，此过程为染色液的熟化过程，储存3个月以上染色效果更佳，注意密封避光保存，长期有效。

3、试剂盒包装加工工艺：

包装盒规格为120mm×70mm×70mm，盒内可存放两个20mL试剂瓶及两只胶头滴管，对试剂盒的瓶签、说明书、封口签进行检验。

4、试剂盒的分装：

4.1取甲醇15ml装入经消毒干燥后的白色试剂瓶，瓶签标记为I液；

4.2取熟化后的染液15ml装入经消毒干燥后的棕色试剂瓶，瓶签标记为II液；

4.3在盒内放入I液、II液，并放入两只胶头滴管和试剂盒使用说明书，包装封口，即为猪附红细胞体病快速镜检诊断试剂盒；

上述所述步骤2.1是将瑞氏染料和姬姆萨染料称量前事先放入38℃温箱干燥箱过夜；

上述所述步骤2.2分别称取：瑞氏染料粉1.4g、姬姆萨染料1.4g。