[发明专利]一种含重组耐高温葡萄糖异构酶细胞的固定化方法

说明书

本发明公开了一种含重组耐高温葡萄糖异构酶细胞的固定化方法：将含耐高温葡萄糖异构酶基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体用pH值6.5‑7.5的缓冲液制成菌悬液；向菌悬液中添加硅藻土，搅拌混匀，再加入聚乙烯亚胺室温搅拌絮凝1～2h，然后加入三羟甲基磷，在0～30℃、100r/min搅拌交联1～2h后，抽滤，滤饼粉碎，得到所述含耐高温葡萄糖异构酶固定化细胞颗粒；本发明固定化细胞具有优良热稳定性和重复使用率，于90℃保温72h保持70.1％以上，在85℃条件下连续催化D‑葡萄糖生成D‑果糖的15个批次中，转化率均大于50％，并且催化剂仍保留85.8％以上初始酶活。

(一)技术领域

本发明涉及一种固定化细胞的技术与应用，特别涉及一种制备具有高温优良热稳定性的固定化重组耐高温葡萄糖异构酶细胞的方法，以及在高温下异构化D-葡萄糖制备D-果糖的应用。

(二)背景技术

葡萄糖异构酶(glucose isomerase，简称GI，EC 5.3.1.5)，在体外主要用于催化D-葡萄糖异构化生成D-果糖，是工业上利用生物转化法制备高果糖浆的关键酶。

高果糖浆(high fructose corn syrup，简称HFCS)是D-葡萄糖和D-果糖的混合物，是一种重要的甜味剂。根据其D-果糖含量的不同，HFCS可分为HFCS-90、HFCS-42和HFCS-55。1967年和1970年，HFCS-42和HFCS-55先后被引入食品行业，以改善饮料和各种食品的甜度。其中，HFCS-55是主流甜味剂。目前，HFCS工业化生产流程是通过固定化GI生物转化法先制得HFCS-42，将其浓缩至HFCS-90，再经勾兑以制得HFCS-55。(Moeller et al,Journal ofthe American College of Nutrition,28:619-626,2009)。

GI介入的D-葡萄糖异构化过程是热力学平衡反应，在85℃或更高的温度下进行生物转化，所生成的具有高D-果糖浓度的HFCS可有效降低后续富集HFCS-90的成本。目前，很多研究致力于挖掘新型耐高温GI或改造现有酶，以提高其高温热稳定性。其中，较为突出的范例是来自于Thermus oshimai的耐高温GI(ToGI)，在添加20mM Mn²⁺，于85℃保温48h，仍具有80％以上的初始酶活，该热稳定性优于已报道的耐高温GI催化剂(Jia et al,EnzymeMicrobial Technology,99:1-8,2017；郑裕国等,一种葡萄糖异构酶、基因、载体、工程菌及其应用,专利申请号CN201610999999.4)。

固定化酶(细胞)是通过物理、化学的方法把酶(细胞)固定成具有高活力、水不溶性、颗粒状的固定化制剂，以实现生产的连续化、自动化、低成本化。固定化GI的方法主要有吸附法、交联法、共价结合和包埋法。其中，最为常用是利用戊二醛(GLU)作为交联剂的交联法(Ge et al，Applied Biochemistry and Biotechnology,69:17-29,1998)。但是，对于一些耐高温酶，以GLU交联剂为例，在交联固定后的高温催化条件下，GLU与酶氨基物质形成的C＝N键很容易水解，会导致固定化酶的活力损失严重。因此，为了增强固定化耐高温酶(如ToGI)在高温反应时的热稳定性，需要考察不同交联剂的应用效果。鉴于此背景，为了研制新型的固定化耐高温GI制剂，本发明考察了丁二醛、对苯二醛、戊二醛和三羟甲基磷(THP)对耐高温ToGI的固定化效果，比较了四种固定化酶(细胞)的高温热稳定性，得到的固定化产品在更高温度下拥有更好的热稳定性，可以用于高温下生产HFCS，对于推动HFCS生产工艺的改进具有重要意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种改良的、提高性能(如热稳定性)的、适用于耐高温ToGI重组细胞的固定化方法，以及该固定化催化剂在高温下连续生物催化D-葡萄糖异构化为D-果糖的应用。

本发明采用的技术方案是：