[发明专利]一种烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2及其克隆方法与应用

说明书

本发明公开了一种烟草腋芽生长调控基因NtMAX3‑2及其克隆方法与应用，烟草腋芽生长调控基因NtMAX3‑2核苷酸序列如SEQ ID：No.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID：No.2所示。本发明还公开了烟草腋芽生长调控基因NtMAX3‑2的克隆方法，具体步骤包括：A、确定NtMAX3‑2基因序列；B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；C、根据NtMAX3‑2基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；D、回收和纯化PCR产物；E、纯化产物与载体连接，转化感受态细胞；F、筛选阳性克隆，对阳性克隆PCR扩增、测序。通过调控烟草腋芽生长调控基因NtMAX3‑2的表达，可抑制打顶后烟草腋芽的形成，从而有望降低烟用抑芽剂使用，为生产绿色优质烟叶和降低人工成本提供基因资源。

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2及其克隆方法与应用。

背景技术

烟草（Nicotianatabacum）是重要的经济作物，是茄科一年生草本植物。打顶抹芽是优质烤烟种植过程中一项重要的生产技术措施。烟草在一定的生长时期必须打顶，而打顶后会萌生大量的侧芽。侧芽耗费营养，会降低烟叶的品质和产量，因此必须抹掉侧芽。人工抹芽耗费人力和物力，增加烟叶生产成本；打顶后施用化学药剂可抑制腋芽生长，降低烟叶生产劳动强度，但化学药剂需要成本，且会造成环境污染。以发现打顶后产生侧芽（腋芽）的相关基因为突破口，通过生物技术创建无侧芽、少侧芽或小侧芽的烟草，则有可能从根本上或大幅度解决上述问题，从而实现 烟草生长量、烟叶品质、环保等方面均有较大提升和改善。

MAX3是独脚金内酯合成途径基因。其在控制分枝生长中的功能已有报道，拟南芥MAX3基因突变后分枝增加。我们对烟草NtMAX3-2基因也进行了广泛理论研究和应用实践，发现过表达NtMAX3-2在烟草打顶后具有抑制侧芽（腋芽）形成的功能。通过植物基因工程技术控制烟草腋芽形成具有生产应用重要意义。

国际上一些知名烟草公司和研究机构正采用生物技术对烟草无腋芽、少腋芽品种进行研究，以提高烟草品质，减少对烟草打顶后化学药剂的施用，以降低烟叶生产劳动强度、化学药剂成本和环境污染。目前，我国也提出了无腋芽优质烟的开发计划，为烟草无腋芽、少腋芽品种研究提供了契机。随着烟草无腋芽、少腋芽品种研究的深入，必将使我国烟草腋芽控制迈上新台阶，为我国烟叶的健康和可持续发展奠定基础。因此，开发一种调控腋芽生长的候选基因，通过基因操作减少烟草腋芽是非常必要的。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2；第二目的在于提供所述的烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2的克隆方法；第三目的在于提供所述的烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：

A、确定NtMAX3-2基因序列；

（1）根据拟南芥MAX3基因（GenBank登录号(NM_130064.4)的蛋白质序列，搜索NCBI数据库得到烟草中同源基因NtMAX3-2序列。利用此序列设计基因克隆引物：