[发明专利]GLP-1样化合物的生物学活性的体外检定方法

说明书

本发明涉及了一种GLP‑1样化合物体外生物学活性检定的方法。该方法是在U2OS/GLP‑1R细胞种上加入梯度稀释的GLP‑1样化合物、然后检测并分析。本申请用高内涵对结果进行图像采集、数据输出，确保结果快速分析；用Soft Max(v4.8)软件对高内涵输出数据进行四参数曲线拟合，实验结果有较高准确度。本发明方法能够高效率、高特异、低成本、高稳定性的对GLP‑1样化合物进行活性检定，实现了药品的高内涵检测。

技术领域

本申请涉及GLP-1样化合物的生物学活性的体外检定方法。

背景技术

GLP-1是胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1)。其由160个氨基酸的胰高血糖素原前体，经不同组织的特异性翻译和修饰，形成不同的终产物。例如，肠粘膜L细胞能形成37个氨基酸的GLP-1(1～37)，水解除去N端6个氨基酸就成为GLP-1(7～37)，或酰胺化为GLP-1(7～37)-NH₂，后两者是目前已知的在机体内具有药理作用的主要GLP-1结构。

GLP-1通过与细胞膜上的受体GLP-1R结合而发挥功能，例如，促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌等，因此，GLP-1R是治疗II型糖尿病的一个关键靶受体。GLP-1R属于B族GPCR(G蛋白偶联受体)，其包括1个胞外N端结构域(N-terminal domain,NT)、3个胞外环状结构域(EC1～3)、3个胞内环状结构域(IC1～3)、7个跨膜结构域(TM1～7)、以及1个胞内C端结构域(CT)。人的GLP-1R有463个氨基酸。

GLP-1的体内半衰期很短，只有约5min，它易被二肽基肽酶IV(Dipeptidyl-peptidase IV,DPP-IV)降解成无活性的GLP-1(9～36)酰胺或者GLP-1(9～37)。为了延长作用时间，已有人研发了多种GLP-1类似物(本文称GLP-1样化合物)，这些化合物通过影响GLP-1R信号通路，象GLP-1一样发挥促胰岛素分泌和/或抑制胰高血糖素分泌等作用，由此可以达到治疗II型糖尿病的目的。

CN103966171A披露了一种骨肉瘤U2OS细胞株，该细胞株在细胞膜上表达GLP-1R与荧光蛋白的融合体，该申请证实，这种U2OS/GLP-1R细胞株能用荧光强度指示促胰岛素分泌肽Exendin-4的浓度。

发明内容

本申请的一个目的是建立一种检测GLP-1样化合物体外生物学活性的方法。所述方法能够以低成本、高特异性、高效地大规模检测GLP-1样化合物的体外活性。

根据本申请，GLP-1样化合物与U2OS/GLP-1R细胞表面的受体GLP-1R结合，可导致与受体偶联的荧光蛋白由原本相对均匀地散布于细胞上而变得聚集、甚至形成斑点，表现为平均的单细胞荧光强度增强。GLP-1样化合物的浓度不同，荧光强度的增强也不同。通过捕捉这种荧光强度的变化，可以表征GLP-1样化合物的活性大小。

在本文中，GLP-1样化合物是指能与GLP-1R受体结合的化合物。所述化合物例如，GLP-1，首个从动物体液提取出的GLP-1类似物exendin-4及其合成形式艾塞那肽(Exenatide)，另外例如利拉鲁肽(Liraglutide)，利司那肽(Lixisenatide)，阿必鲁肽(Albiglutide)，度拉糖肽(Dulaglutide)，索玛鲁肽(Semeglutide)，以及各种在研的GLP-1模拟物，等等。

在本文中，骨肉瘤U2OS细胞或骨肉瘤U-2OS细胞可互换使用，并可以从ATCC等细胞保藏中心购买得到。