[发明专利]不溶血无乳链球菌WC1535△cyl及其构建和应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种不溶血无乳链球菌WC1535△cyl及其构建和应用；本发明的鱼源无乳链球菌菌株为不溶血无乳链球菌WC1535△cyl，该菌株于2017年7月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:60210。该菌株是与野生株相比不具有溶血活性，特别是对罗非鱼的毒性大大降低；该菌株安全性高，不存在毒力返强的风险，而且具有很高的免疫原性，能够保护免疫鱼类抵抗无乳链球菌的入侵，同时该菌株易培养、生产成本低、使用简便，并且具有开发成口服弱毒活疫苗的潜力；本发明所涉及的菌株可用于制备鱼链球菌病的弱毒活疫苗，具有很高的商业应用价值。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种不溶血的鱼源无乳链球菌弱毒株，无乳链球菌WC1535△cyl及其构建和应用。

背景技术

鱼链球菌病主要是由无乳链球菌和海豚链球菌引起的。目前，在我国养殖的经济鱼类中，已报道感染链球菌病的鱼类主要有罗非鱼、卵形鲳鲹、宝石鲈、鲮鱼、齐口裂腹鱼和大菱鲆等，其中无乳链球菌是主要的致病菌，严重威胁着我国水产养殖业的健康发展。目前，鱼链球菌病的防控主要依赖抗生素、消毒剂、微生态制剂和疫苗免疫等；由于治疗过程中抗生素的大量使用，使得病原菌出现了耐药性，导致药物治疗和预防的效果显著下降。而针对鱼链球菌病的疫苗主要是灭活疫苗，灭活疫苗不仅因为需要注射、操作不便和效果不理想等原因，使用范围非常有限，目前尚无商业化的疫苗产品；而且灭活疫苗接种后在动物体内不能增殖，通常免疫剂量较大，保护周期相对较短，需要多次免疫接种，单次免疫往往不能产生较强的免疫保护效果。因此，开发有效的弱毒活疫苗对预防鱼链球菌病具有重要的现实意义。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种不溶血的鱼源无乳链球菌弱毒株，即无乳链球菌WC1535△cyl。该菌株不仅毒性小，而且免疫原性强等优点；其对鱼的致病性显著降低，同时通过投喂可以侵染罗非鱼，并且能够在鱼体内长时间存活，能够激活机体产生抗体，具有良好的免疫保护效果。

本发明的目的之二是提供了所述无乳链球菌WC1535△cyl的构建。

本发明的目的之三是提供了所述无乳链球菌WC1535△cyl的应用。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明所述的无乳链球菌WC1535△cyl，为不溶血的鱼源无乳链球菌弱毒株，于2017年7月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:60210，外文名称为Streptococcus agalactiae。

所述无乳链球菌WC1535△cyl的构建方法，包括如下步骤：

(1)将重组质粒pSET4s-cylCm经过电转化至鱼源无乳链球菌WC1535株感受态细胞，涂布于含有氯霉素的BHI平板，置于28±2℃倒置培养30～40h；

(2)再挑取培养所得单克隆至含有氯霉素的BHI液体培养基中，28±2℃培养至对数生长期，然后稀释10000倍，涂布于无抗性的BHI平板上，于37℃倒置培养；得到所述无乳链球菌WC1535△cyl。

挑取单克隆进行菌落PCR验证，引物为cyl-dF和cyl-dR。

cyl-dF：5′-TACCTCCTTGAAGATTGCTACG-3′

cyl-dR：5′-TGTTTCTGGCCTTTCTACTACC-3′