[发明专利]一种干细胞活性因子凝胶的制备方法及在难愈合伤口治疗中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞与组织工程技术领域，尤其涉及一种治疗慢性难愈合伤口的干细胞活性因子凝胶制备方法。

背景技术

慢性难愈性伤口又称溃疡，是指由各种原因引起的经一个月以上治疗未能愈合的创面。目前以糖尿病足、创伤性溃疡、褥疮和下肢静脉性溃疡最常见。它们多发生于糖尿病、创伤、静脉曲张、血管硬化、截瘫长期卧床等严重慢性和急性损伤的患者，并且随着年龄的增加，发病率呈明显上升趋势，具有发病机制复杂、病程长、涉及学科多、治疗难度大以及治疗费用高等特点。目前，慢性难愈合伤口已经成为影响社会和谐发展、严重降低人们工作和生活质量以及加重社会和家庭负担的重要因素。

现有治疗方法有血管形成术、生物敷料治疗、高压氧治疗、细胞因子治疗、细胞治疗等方法。其中生物敷料的使用是目前治疗所必须采用的方法，因为保持一个湿润清洁的创面环境可以防止组织失水、细胞坏死、有利于血管的生成。而随着技术的进步，含有生长因子的新型生物活性敷料被开发出来，生长因子在创面的修复过程中发挥着非常重要的作用，它参与整个创面的修复再生。慢性难愈合伤口经久不愈的一个主要原因就是因为内源性生长因子释放的减少，组织再生修复能力下降。

间充质干细胞是一种取材方便，不被异体免疫排斥，具有多向分化潜能的干细胞。间充质干细胞培养体系中含有多种活性成份。已经被证明对缺血性心肌、骨组织具有再生修复作用，在治疗难愈性伤口的研究中也多有报道。申请号为200810136415.6的发明专利公开了一种使用甲基纤维素作为细胞基质的人脐带间充质干细胞创面涂抹剂的制备方法，但是该发明含有抗生素庆大霉素，不适用于抗生素过敏人群；而且涂抹剂快速配制中含有动物源成分胎牛血清，有可能造成过敏以及具有动物源性安全隐患；快速配制中操作步骤多，过程繁杂，带来微生物污染风险，运输前不能按照药典要求完成两周的无菌检测，制品质量无法保证。申请号201210133427.X、申请号20161088226.0的发明专利都是是直接使用活性细胞，但是单纯的细胞悬液很难附着在创口表面持续发生作用，并且单纯的细胞悬液中活细胞的数量随着用药时间的延长而降低，不能保证足够的活细胞发挥治疗作用且不利于储存和运输。

大量的研究显示间充质干细胞主要依靠的是其强大的旁分泌能力实现血管再生修复的，如血管内皮细胞生长因子的释放。因此，如何从干细胞的培养基中分离浓缩干细胞分泌的活性细胞因子成为干细胞临床应用的关键。本发明使用了一种简单的方法从干细胞培养基中分离浓缩活性因子，且不需要进一步分离，可直接制备成凝胶用于治疗慢性难愈合伤口，非常具有应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种干细胞活性因子凝胶的简单制备方法，解决了现有技术中使用活性干细胞引发的各种弊端或干细胞活性因子凝胶制备复杂等存在的问题，为治疗皮肤损伤提供了有效的治疗手段。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是，一种干细胞活性因子凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)活性因子悬液的制备：从脐带、脂肪、胎盘分离、纯化所述间充质干细胞，使用含10％胎牛血清的DMEM或DF12培养基、常规培养，待细胞融合度达80-90％时，用胰蛋白酶消化，使用上述完全培养基进行中止，离心收集细胞，再用无血清DMEM或DF12培养基悬浮细胞沉淀，调整细胞浓度传代培养，收集10代以内的培养上清，离心除掉不溶性杂质和变性蛋白，取上清液用于活性因子的分离纯化。

(2)活性因子分离纯化：将上清液与经过无菌处理的质量浓度为1～10g/L壳聚糖10:1-20:1混合，调节pH值，然后置于摇床中振摇，离心，沉淀经弱碱性水溶液洗涤溶解。

(3)干细胞活性因子凝胶的配制：在上述活性因子浓缩液逐滴添加保湿剂，边添加，边进行混合，所述保湿剂剂与活性因子悬液的体积比为1∶3；混合均匀后，分装到预充注射器中，放到-20℃冰箱中冻存待用。

本发明步骤3中的保湿剂为透明质酸钠。

本发明步骤3所述保湿剂与活性因子悬液的体积比为1∶3。

本发明所述的干细胞活性因子凝胶的制备方法制得的干细胞活性因子凝胶在难愈合伤口治疗中的应用本发明所述间充质干细胞经体外分离、筛选、传代、扩增后制备而得，它们贴壁生长，表达CD29、CD73、CD90、CD105 等细胞表面蛋白分子，而不表达CD11b、CD34、CD45、HLA-DR 等细胞表面蛋白分子；它们具有自我更新、组织修复、免疫调节能力，可以向中胚层谱系分化，如向脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞分化，也可以向其它胚层谱系分化，如向表皮细胞、血管内皮细胞分化。