[发明专利]生菜作为宿主在表达神经生长因子中的应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及生菜作为宿主在表达神经生长因子中的应用。本发明利用重组载体以及农杆菌介导真空渗透方法来表达人神经生长因子(NGF)。该表达体系确定植物外源蛋白在农杆菌侵染4d后就可以收集。利用SDS‑PAGE法、免疫印迹法(Western法)确定重组NGF成功表达。神经细胞实验证明生菜生产的NGF具有生物学活性。本发明提供了一种低成本、方便、大量生产具有活性重组人NGF的方法。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及生菜作为宿主在表达神经生长因子中的应用。

背景技术

人神经生长因子(NGF)是神经营养因子，主要参与某些目标神经元的生长，维持，增殖和存活的调节。它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。事实上，NGF对于交感神经和感觉神经元的存活和维持至关重要，因为它们在不存在时会发生细胞凋亡，NGF也参与调节神经元生命周期的途径。当表达时，NGF最初是3个蛋白质的α-NGF，β-NGF和Gamma-NGF(2:1:2比例)的7S，130kDa复合物。这种形式的NGF也称为proNGF(NGF前体)。该复合物的γ亚基作为丝氨酸蛋白酶，并切割β亚基的N末端，从而将蛋白激活成功能性NGF。术语神经生长因子通常指蛋白质的2.5S，26-kDaβ亚基，这是生物活性的7S NGF复合物的唯一组分(即作为信号分子)，由两个118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合而成的二聚体。

神经生长因子可以预防或减少神经变性疾病。NGF可以抑制炎症，治疗视神经损伤，促进髓鞘修复。NGF也可以用于治疗多发性硬化症，NGF也可参与各种精神疾病，如痴呆，抑郁症，精神分裂症，自闭症，Rett综合征，神经性厌食症和神经性贪食症，新生儿缺血缺氧性脑病、小儿脑瘫等。

NGF主要从小鼠，蛇毒，以及人体胎盘中提取。商业生产NGF主要是从小鼠颌下腺中收集。由于小鼠颌下腺原料供应不足，而且提取技术繁琐，导致NGF产量远远达不到临床的需求量，致使NGF价格快速上涨。而且，小鼠中潜在的病原体也使得目前从颌下腺中来源的NGF存在各种风险，存在与人交叉感染的问题。为了消除这种来自小鼠的潜在风险，利用基因工程技术生产重组NGF(rNGF)可以作为大规模生产一种更安全以及低成本的NGF的来源。

植物作为药物蛋白质的表达和生产系统，已经研究了近三十年。除了低成本和产量高等的优点外，基于植物的表达系统还降低了人和动物病原体从产生蛋白质的过程中传播到人类的风险。此外，植物真核蛋白内膜表达系统和分泌途径类似于哺乳动物细胞。植物表达系统可大量生产大分子量以及多亚基的药物蛋白质，且大大优于原核生物表达系统，比如大肠杆菌表达系统。如需要翻译后修饰的，糖基化的蛋白，以及需要组装的单克隆抗体，其不能用原核系统实现。利用植物生产的药用蛋白作为生物试剂已经商业化，或用作家禽的疫苗添加剂。2012年，美国食品和药物管理局(FDA)批准了用于治疗遗传疾病1型戈谢病的蛋白ELELYSO^TM(taliglucerase alfa)，而这种蛋白是利用胡萝卜生产的。在过去十年中，人们对药物蛋白质的需求急剧增加，所以FDA批准用于临床试验的植物药用蛋白质的数量也在不断增加。

植物瞬时表达系统可以大量生产重组蛋白用于临床研究或者应对突发性疾病。2014年，唯一用于有效抵抗埃博拉病毒爆发的抗体治疗药物，ZMappTM，就是农杆菌渗透方法在烟草叶片中生产。ZMapp的功效和安全性为推动植物制药业的行业开辟了道路。目前，烟草瞬间蛋白表达最常见的宿主植物，并且已经开发了各种载体和农杆菌渗透方法，用于在短时间内进行大规模生产。然而，烟草具有高纤维含量和潜在的有毒化合物，如生物碱尼古丁，显著增加了下游纯化过程中的成本，极大地阻碍了植物外源蛋白药物的进一步发展。与烟叶系统相比，生菜中含有更少的酚类和有毒化合物，因此，将生菜作为宿主在表达人神经生长因子具有重要的现实意义。

发明内容