[发明专利]一种高效表达外源蛋白的启动子样基因及其应用

说明书

本发明公开了一种高效表达外源蛋白的启动子样基因，其是能够在原核细胞组成型表达外源蛋白的启动子样基因，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示或者为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的截短序列；该基因序列通过构建含氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）为报告基因的表达载体，将待筛选基因片段和筛选重组载体进行连接、转化、构建基因文库，采用氯霉素抗性筛选出含有启动子样基因序列的重组菌株，从而获得启动子样序列，该序列能够在原核细胞中高效的组成型表达报告基因氯霉素活性和外源蛋白。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种在原核细胞中组成表达外源蛋白的启动子样基因序列，用于在原核细胞中高效的表达外源蛋白。

背景技术

近些年，随着基因工程和分子克隆技术的发展，原核表达系统被越来越多的应用于外源蛋白的表达，外源蛋白的表达在抗体制备、药物合成和食品加工中发挥着越来越重要的作用。外源蛋白表达时，构建高水平表达异源蛋白的表达载体，启动子对外源基因的表达水平影响极大。启动子(promoter)是一段RNA聚合酶识别、结合和起始转录的特定DNA序列，它位于基因的上游。其长度因生物种类而异，一般不超过200 bp，分为组成型启动子和诱导型启动子。诱导型启动子就是在某些特定的物理或化学条件的刺激下，可以大幅度地提高基因的转录水平，其特点是启动子的作用受到物理或化学信号的诱导；而组成型启动子相比于诱导型启动子具有：表达持续时间久，RNA和蛋白质表达量相对恒定，它们不表现时空特异性，也不受外界因素的诱导。

本发明所筛选的组成型启动子样基因序列采用了启动报告基因表达的思路，即氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）组成型表达作为报告基因，在启动子样序列插入后，菌株表现出氯霉素抗性而且抗性得到提高，因而通过增加氯霉素浓度达到大规模筛选以获得相应的启动基因表达的序列。

目前发现的组成型启动子样序列（Constitutive Promoter，CP）一般具有特异性不高且蛋白的表达量低。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够在原核系统中高效表达外源蛋白的组成型启动子样基因，该启动子样基因ZJ-37核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的截短序列37T1。

本发明的组成型启动子样序列能够启动多种外源蛋白的表达，且蛋白表达水平相对于诱导性启动子没有明显差别，进而解决一些组成型启动子只能表达特异蛋白和产率低的问题。

本发明用抗生素基因CAT作为报告基因，筛选的组成型启动子37T1能够启动外源蛋白的高效表达，而且有一定的启动效果，在改善异源基因原核表达系统方面具有重要实用价值。

本发明中截短序列37T1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中的98~141bp所示，即如SEQID NO：2所示。

本发明首先提取云南昆明捞鱼河（北纬24°50′53″，东经102°51′50″）淤泥中混合菌基因组，酶切得到500bp以下DNA片段，由此构建到筛选载体报告基因CAT上游，通过氯霉素抗性报告基因筛选含启动子序列样的菌株，之后，对菌株的氯霉素抗性、启动子样截短序列的顺反性及启动外源蛋白表达的能力进行检测。

本发明通过如下技术方案实现本发明目的：

（1）构建含融合报告基因的重组筛选菌株

首先提取捞鱼河淤泥中混合菌基因组，酶切得到500bp以下DNA片段，利用同尾酶的特性连接到重组载体pCMR8a的CAT基因上游，转化入大肠杆菌感受态细胞中，培养；设置不同浓度梯度的氯霉素，筛选出在高氯霉素浓度下生长的菌株，即含启动子样基因序列且启动能力较强的菌株被筛选出来。

（2）同源性分析序列来源及筛选启动能力最强的启动子