[发明专利]肺癌组织lncRNA荧光原位杂交检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种肺癌组织lncRNA荧光原位杂交检测方法。

背景技术

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤。研究表明lncRNA参与人体恶性肿瘤的发生、发展。LncRNA在肺癌中的作用是医学研究的热点也是难点。如何检测目标lncRNA在肺癌组织的表达是学者们面临的首要问题。

肺癌组织内lncRNA的定量分析常用方法是RT-PCR；核质分离RT-PCR用于lncRNA定位分析。但是这些实验步骤繁琐，操作复杂。更重要的是提取肺癌组织RNA，常包含肿瘤间质细胞的RNA，不能完全反应肿瘤实质细胞中lncRNA的表达情况。

原位杂交检测具有重大技术优势。目前肺癌肿瘤细胞系内lncRNA的原位检测技术比较成熟，但是肺癌组织中lncRNA的荧光原位杂交技术一直不成熟。肺癌病理类型复杂，组织异型性明显。敏感性较差的原位杂交技术检测不出lncRNA的表达。肺癌间质内探针残留过多，背景染色较差，实质染色与间质残留区分不明显。因此，肺癌组织lncRNA荧光原位杂交检测技术有待进一步改进优化。

中国专利201611041669.0，公开日2017年01月25日公开了一种食管鳞癌组织中lncRNA的荧光原位杂交检测方法，包括：制备冰冻食管鳞癌组织切片，进行固定、消化与通透，采用lncRNA探针进行检测，进行DNA染色，封片，采用共聚焦显微镜检测成像或荧光显微镜检测成像。然而肺癌组织与食管鳞癌组织有很大不同，食管鳞癌以实性组织为主，肺癌组织内常残留含气的空腔及阻塞性肺气肿，且周围被肺泡组织包绕。因此有必要针对肺癌组织的特异性，进一步优化实验条件，改进实验步骤，设计肺癌组织lncRNA荧光原位杂交检测方法。然而现有技术中，关于本发明的肺癌组织lncRNA荧光原位杂交检测方法，目前还未见报道。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供一种肺癌组织lncRNA荧光原位杂交检测方法，用于肺癌组织内lncRNA的表达水平及亚细胞定位分析。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种肺癌组织lncRNA的荧光原位杂交检测方法，包括：制备冰冻肺癌组织切片，组织固定、消化与通透，lncRNA探针杂交检测，DNA染色，封片，荧光检测成像。

进一步地，所述的lncRNA探针采用Cy3标记。

进一步地，所述的肺癌组织lncRNA的荧光原位杂交检测方法还包括：根据lncRNA成像位置，判断lncRNA是定位于细胞核还是细胞质，还是核质均匀表达。

进一步地，所述的肺癌组织lncRNA的荧光原位杂交检测方法还包括：根据肺癌组织中lncRNA成像的荧光光密度，计算lncRNA在肺癌组织中的相对表达量。

进一步地，所述的采用lncRNA探针进行检测的方法包括如下步骤：

(1)肺癌组织切片中加入预杂交液，37℃封闭40min；

(2)在避光条件下，将lncRNA探针加入到37℃的杂交液中，得到lncRNA探针杂交液；

(3)弃去组织切片中的预杂交液，加入lncRNA探针杂交液，室温杂交过夜，避光条件下清洗组织。

进一步地，所述的DNA染色采用DAPI进行复染。

进一步地，所述步骤1中的预杂交液由Blocking Solution与Pre-hybridization Buffer按照1:99比例混合制成。

进一步地，所述步骤2中的杂交液由Blocking Solution与Hybridization Buffer按照1:99比例混合制成。

本发明根据ATCG互补法则，特异性探针与lncRNA互补结合，检测lncRNA在肺癌组织的表达水平。DAPI与双链DNA结合，为常用的细胞核荧光染料。在荧光激发下，Cy3标记的探针显红色；DAPI显蓝色；颜色对比明显，互不干扰。根据目标lncRNA的荧光光密度，计算lncRNA在肺癌组织内的表达量。通过检测目标lncRNA的成像位置，判断目标lncRNA在肺癌组织中是细胞核表达还是细胞质表达。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明的肺癌组织lncRNA荧光原位杂交技术，可以快速、准确地检测lncRNA的表达情况，为研究lncRNA在肺癌中的作用奠定基础。

2、本发明对荧光原位杂交图像进行高质量成像，直观检测lncRNA的表达，并原位展示lncRNA的亚细胞定位。