[发明专利]一种荷斯坦奶牛脾脏源抗菌肽及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种从荷斯坦奶牛脾脏中分离得到的具有抗菌活性的抗菌肽，即荷斯坦奶牛脾脏源抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明抗菌肽分离于奶牛脾脏，而脾脏为动物免疫器官之一，参与血液储存和免疫过程，溶血率极低，而且具有抗菌谱广、杀菌快速、高度选择性、不产生耐药性、无致畸作用、不易产生蓄积中毒等一些安全无毒副作用的生物学特性，而且抗菌谱广，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌都具有高效的抗菌作用，可用于制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或/和真菌感染的药物，还可用作饲料添加剂或食品添加剂。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从荷斯坦奶牛脾脏中分离出的具有抗菌活性的抗菌肽及其编码序列和用途。

背景技术

抗生素的应用给人类和动物的疾病治疗带来了极大便利。但是，随着抗生素的大量使用或滥用，多重耐药菌的出现给人类和动物疾病的治疗带来了巨大挑战，同时抗生素残留问题及抗生素的副作用对人类和动物健康造成了巨大威胁。因此，寻找抗生素替代物成为必然选择。

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是生物机体先天免疫系统中的重要组成部分。抗菌肽的分子量小，一般由10～60个氨基酸残基构成。抗菌肽除了具有广谱的抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生虫等活性，同时还具有抗肿瘤、免疫调节、中和内毒素等活性。抗菌肽的杀菌机理与抗生素不同。抗菌肽一般带正电荷，可与带负电荷的靶细胞膜作用，破坏其完整性并产生穿孔现象，使得胞内容物大量渗出，从而达到抗菌作用。而病原菌对抗菌肽一般不会产生耐药性。因此，抗菌肽是抗生素替代物中的佼佼者。

脾脏是人和动物的重要外周免疫器官，参与机体的体液免疫和细胞免疫。脾脏中有T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突状细胞、红细胞、巨噬细胞等免疫相关细胞，也存在着重要的功能分子，如促吞噬素(Tuftsin)、免疫球蛋白、补体等。脾脏中的细胞和分子共同抵抗外来病原微生物的侵袭，从而保障机体健康。有研究表明，牛脾脏粗提物中存在着抗菌活性物质。

目前，尚未见到从牛脾脏内进行抗菌肽分离与鉴定的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种从荷斯坦奶牛脾脏中分离的具有抗革兰阳性菌、革兰阴性菌及病原真菌活性的抗菌肽及其制备方法与应用。

为实现发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种荷斯坦奶牛脾脏源抗菌肽，所述抗菌肽的氨基酸序列如下：

Arg-Pro-Pro-Ile-Arg-Pro-Pro-Phe-Tyr-Pro-Pro-Phe-Arg-Pro-Pro-Ile-Arg-Pro-Pro-Ile-Phe-Pro-Pro-Ile-Arg-Pro-Pro(SEQ ID NO.1)。

上述荷斯坦奶牛脾脏源抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)脾脏粗提物的制备：取健康荷斯坦奶牛脾脏，去除表面包膜，剪碎后进行组织匀浆、超声破碎，然后加入等体积的浓度(质量分数浓度)为5％乙酸，于冰浴中搅拌6h；然后于4℃、8000转/分的条件下离心30min，离心后取上清，将上清于38-40℃进行旋转蒸发至乙酸完全蒸出为止，收集旋转蒸发后剩下的液体，冷冻干燥，得到脾脏粗提物；

(2)抗菌肽的纯化：将脾脏粗提物用乙酸溶解，得到脾脏粗提物溶液，将脾脏粗提物溶液通过阳离子交换柱，脾脏粗提物溶液中的阳离子成分结合到阳离子交换柱上，然后用25mmol/L的乙酸铵缓冲液(pH5.4)以50mL/h的流速通过阳离子交换柱，洗去未结合的成分，再用浓度(质量分数浓度)为10％乙酸以50mL/h的流速洗脱阳离子交换柱上结合的阳离子成分，洗脱过程用紫外检测仪测量洗脱组分在230nm波长的吸光值，收集阳离子洗脱峰；将收集的阳离子洗脱峰组分利用反相高效液相色谱进一步分离，收集第7个出现的洗脱峰所对应的洗脱组分，冷冻干燥即得荷斯坦奶牛脾脏源抗菌肽。