[发明专利]一种基于双单抗夹心的磁酶免疫双重定量ELISA检测方法

说明书

本发明公开了一种基于双单抗夹心的磁酶免疫双重定量ELISA检测方法，用样品稀释液将目标蛋白A单克隆抗体包被的免疫磁珠稀释后，加入到目标蛋白B单克隆抗体包被的酶标板，磁性分离洗涤后，分别加入不同浓度梯度的目标蛋白A和目标蛋白B标准品混合液和待测血清样品，孵育及磁性分离洗涤后再加入HRP或ARP标记的目标蛋白A和目标蛋白B单克隆抗体混合液形成目标蛋白A双抗夹心复合物和目标蛋白B双抗夹心复合物，孵育后将目标蛋白A双抗夹心复合物转移至新的微孔板上，对目标蛋白A双抗夹心复合物进行磁性分离洗涤，对目标蛋白B双抗夹心复合物进行常规ELISA洗涤后，加入显色液，37℃避光显色，终止反应后上机检测并绘制标准曲线，根据标准曲线的线性关系即可计算待测血清样品中目标蛋白A和目标蛋白B的含量。

技术领域

本发明涉及定量ELISA检测方法，具体涉及一种基于双单抗夹心的磁酶免疫双重定量ELISA检测方法。

背景技术

免疫磁珠酶联免疫法(Immunomagnetic bead ELISA，IMB-ELISA)简称磁酶免疫法，是20世纪80年代末发明的一种标记免疫检测技术，该方法将磁微粒分离与酶联免疫测定技术相结合，以高均一的磁性微球为固相支持物，采用超顺磁性微粒液相分离代替普通酶联免疫酶标板包被法的固相分离，在外加磁场的作用下方便地分离游离物和结合物。由于纳米磁珠颗粒小、表面积大，可结合更多的诊断分子，使蛋白吸附能力超出酶标板载体的1000倍以上，从而使该方法的敏感性高于以普通酶标板为载体的ELISA方法。磁珠上的蛋白质和其相应配基结合并不影响被分离物或其它生物材料的生物学性状和功能，同时具有操作简单、不需昂贵的仪器设备的特点，因而在免疫检测中具有巨大的应用前景。不过，目前的磁酶免疫法都是对目标蛋白A和目标蛋白B分别进行检测，检测过程较繁琐，耗费样本量较大。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于双单抗夹心的磁酶免疫双重定量ELISA检测方法，可同时进行两种蛋白的检测，该检测方法灵敏度高，特异性好，操作简单快速。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种基于双单抗夹心的磁酶免疫双重定量ELISA检测方法，用样品稀释液将目标蛋白A单克隆抗体包被的免疫磁珠稀释后，按100ul/孔加入目标蛋白B单克隆抗体包被酶标板，磁性分离洗涤后，分别加入不同浓度梯度的目标蛋白A和目标蛋白B标准品混合液和10倍梯度稀释的待测血清样品，37℃避光震荡孵育20min-60min，磁性分离洗涤后再加入辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(ARP)标记的目标蛋白A和目标蛋白B抗体混合液，从而形成以免疫磁珠为液相载体的目标蛋白A双抗夹心复合物和以酶标板为固相载体的目标蛋白B双抗夹心复合物，37℃避光震荡孵育20min-60min，将以免疫磁珠为液相载体的目标蛋白A双抗夹心复合物转移至新的微孔板上，对目标蛋白A双抗夹心复合物进行磁性分离洗涤，对目标蛋白B双抗夹心复合物进行常规ELISA洗涤后，加入显色液，37℃避光显色1min-20min，之后加入反应终止液终止反应，然后上机检测读取检测值，根据各浓度目标蛋白A和目标蛋白B标准品对应的检测值，进行线性拟合绘制标准曲线，然后根据标准曲线的线性关系即可计算待测血清样品中目标蛋白A和目标蛋白B的含量。

本发明所述的检测值包括吸光值、发光值和荧光值。所述的显色液包括TMB显色液、化学发光显色液或荧光显色液。

优选地，所述目标蛋白A单克隆抗体包被的免疫磁珠采用以下方法来制备：以商业化羧基修饰的超顺磁性微球作为磁珠载体，经pH 5.0-6.0的10-15Mm MES缓冲液进行清洗后，按1:1的体积比加入1.25M的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液(EDC)，在室温下避光振荡反应25-35min后进行磁性分离，得到活化的磁珠，而后按40-60ug抗体/mg磁珠的比例加入样品稀释液稀释的目标蛋白A单克隆抗体，37℃下避光震荡反应1-3h，磁性分离清洗后，加入含0.1％Tween-20的PBST溶液进行室温震荡反应25-35min，以封闭未结合抗体的游离醛基，最后即得到目标蛋白A单克隆抗体包被的免疫磁珠。