[发明专利]一种诱导成纤维细胞为软骨细胞样细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种诱导成纤维细胞为软骨细胞样细胞的方法，属于细胞生物学技术和再生医学领域。

背景技术

软骨组织（Cartilage tissue）是一种富含蛋白多糖、胶原和透明质酸等物质的组织，由软骨细胞和软骨基质构成，在体内主要起支撑和减少摩擦的作用。但软骨组织缺乏血管，因此，软骨组织一旦受到损伤便很难修复，即便是微小的软骨组织损伤，也很难自然修复。

目前，临床上用于软骨组织损伤修复的方法主要有软骨和软骨下骨去除、微骨折和软骨下骨钻孔、自体骨软骨移植和同种异体骨软骨移植、软骨或骨膜移植等（刘效仿，等. 中华创伤骨科杂志，2014,16(6):537-539）。这些方法在一定程度上均能够对软骨组织损伤进行修复，但均存在明显缺点，如微骨折和软骨下骨钻孔方法能够使干细胞到达损伤部位，但因局部环境和机械应力不同，干细胞很难向软骨细胞分化；自体骨软骨移植安全、有效，但会给患者带来新的创伤；异体骨软骨移植避免了自体骨软骨移植给患者带来的新的创伤，但存在供体来源限制、免疫排斥反应和疾病传播风险等。

软骨组织工程技术的发展为软骨组织损伤的治疗提供了一种新的思路和策略（Vacanti CA, et al., Plast Reconstr Surg, 1991, 88(5): 753-759; Cao Y, et al., Transplant Proc, 1994, 26(6): 3390-3392）。在软骨组织工程中，种子细胞是其最基本的要素之一。目前，用于软骨组织工程的细胞主要有自体或异体软骨细胞、基因修饰细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞等。自体软骨细胞移植不存在免疫排斥反应，无需诱导分化培养即可直接使用，是最佳的软骨组织工程种子细胞，但取材受限，细胞增殖能力低，体外培养易于失去原有表型（Marlovits S, et al., J Bone Joint Surg, 2004, 86(5):286-295）；同种异体软骨细胞是自体软骨细胞移植较好的替代细胞，避免了自体软骨细胞采集造成的新的创伤，但供体来源受限，存在疾病传播风险；基因修饰细胞可通过基因工程技术将细胞因子基因导入软骨细胞内，使其在软骨损伤部位表达细胞因子，促进软骨损伤修复（Sellers RS, et al., J Bone Joint Surg, 2002, 79(6):1452-1463），但基因导入可能存在潜在安全风险；胚胎干细胞的分化潜能最为全面，但其免疫原性也最差，在体内易形成畸胎瘤，且涉及严重的伦理争议；间充质干细胞的组织分布虽较为广泛，但其数量比例较低以及分化能力常受限制（Covas D, et al., Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 2003, 36(9): 1179-1183; Kestendjieva S, et al., Cell biology international, 2008, 32(7): 724-732; Yamazaki H, et al., Stem Cells, 2007, 25(1): 78-87）。

重编程技术以及谱系重编程技术（Lineage reprogramming）的发展为软骨细胞的来源开辟了新的途径。所谓重编程技术是将成熟的成体细胞先转变为诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cells, iPSCs），然后再进一步分化为其它类型的细胞，而谱系重编程技术则是不经过多能干细胞阶段，直接将成体细胞直接转分化为另一类型的细胞。目前，科学家已利用诱导多能干细胞分化出了骨和软骨组织（Hong SG, et al., Cell Reports, 2014 , 7 (4) :1298-1309），但是，目前重编程和谱系重编程技术最为有效的方法是基于载体的转录因子介导方法，由于该方法涉及基因导入，所以存在潜在的安全隐患，因此在临床应用上需严格限制。

综合以上分析，软骨组织损伤修复仍存在诸多问题，特别是用于损伤修复的种子细胞来源问题，仍需寻找一种获得方法相对简单、安全性相对较好的成体细胞分化为软骨细胞的方法。基于此，本发明尝试建立了一种利用鱼卵母细胞提取物诱导成纤维细胞为软骨细胞样细胞的方法（鉴于学术严谨性，诱导的软骨细胞和正常软骨细胞在表观遗传模式方面可能不完全相同，因此，本发明专利将诱导后阿利新蓝阳性染色的细胞称为软骨细胞样细胞）。本发明方法所有步骤均不涉及基因导入操作，产生的软骨细胞样细胞安全性较好，实验操作相对简单，实验的重复性也较好。

发明内容