[发明专利]一种FcγRI受体的ELISA检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种FcγRI(CD64)受体的ELISA检测方法。

背景技术

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生。VEGF由不同肿瘤细胞分泌，也可在发育中的正常细胞及组织中表达，在体内调节血管的通透性，为血管形成过程中的多种细胞提供一个纤维网络；在体外能促进基质的降解以及内皮细胞的增殖、迁移、运动和血管腔样结构的形成，并可动员骨髓来源的内皮祖细胞。VEGF是诱导肿瘤血管形成的作用最强、特异性最高的血管生长因子。所以理论上来说，采用不同方法来干预或抑制血管内皮生长因子可以抑制肿瘤的生长。

治疗性单克隆抗体被广泛用于肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病等治疗。单抗除具有特异性高、不良反应小和作用机制明确等特点外，半衰期长也是其独特的优势。当前的治疗性单抗大多为免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)，已成为一种应对癌症及自身免疫疾病的重要治疗手段。单抗的功效不仅依赖于其抗体结合区域(Fab)，同时其可结晶区域(Fc)也发挥着重要作用。Fab能够特异地识别肿瘤相关抗原(TAA)，从而调控TAA相关的下游信号通路。Fc能够发挥一系列效应功能如ADCC、ADCP和CDC，进一步提升单抗的功效，同时Fc还能结合FcRn从而延长单抗药品的半衰期。

随着对单抗药效要求不断提高，选择合适的IgG亚型以及Fc区域改造是当今单抗研发的一个热点。体内许多细胞表面具有不同类Ig Fc的受体，通过Fc受体与Ig Fc的结合，参与Ig介导的生理功能或病理损伤过程。目前已鉴定明确属于CD抗原的Fc受体有FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32a,b,c)、FcγRIII(CD16a,b,c)。

FcγRI(CD64)是大小为70kDa的穿膜糖蛋白，属Ig超家族成员，胞膜外区有3个C2结构，基因染色体定位于1q23～24。识别CD64的代表性McAb有McAb22、McAb32.2、197和10.1等。FcγRI(CD64)是高亲合力受体，Kd值为10-8～10-9M，主要与人的单体IgG1、IgG3以及小鼠IgG2a和IgG3结合。与人IgG4结合的亲合力明确降低，与IgG2则无结合能力。FcγRI(CD64)主要分布于单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等，但表达水平各不相同。FcγRI(CD64)位点数：15000～40000/每个单核细胞，>50000/巨噬细胞，<1000/新鲜中性粒细胞。IFN-&gamma可刺激单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞表达FcγRI(CD64)水平增加5～10倍，G-CSF也有这种促进作用。

近年来，生物膜干涉技术(biolayerinterferomeory，BLI)、biacore技术等被用于FcγRI(CD64)结合活性的测定，虽然简便快捷，但需要价格昂贵的大型设备，不利于普通实验室、小型生物公司的技术研发及产品质量的跟踪监测。而酶联免疫吸附测定法(ELISA)方法，因其操作简单、快速、敏感性高、特异性强、设备要求简单，因此在实验室广泛应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是本发明创新性的利用夹心ELISA方法检测抗VEGF单抗与FcγRI(CD64)受体的的结合能力，使抗体样品体外与FcγRI(CD64)受体的结合活性的检测能够更加简单易行。利用本专利检测方法能在体外快速、直接检测出抗VEGF单抗与FcγRI(CD64)受体结合活性，且成本较低，实验操作方便，重复性好，结果判断客观、灵敏度高。为抗VEGF单抗的一致性评价及临床药效及药代动力学研究也提供了参考信息。

为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为一种用ELISA方法检测抗VEGF单抗与FcγRI-CD64受体的结合活性，即一种FcγRI-CD64受体的ELISA检测方法,其包括在酶标板上包被FcγRI-CD64的包被步骤、封闭、样品配制、二抗孵育、底物显色的步骤，且所述样品配制步骤为：抗VEGF单抗与抗原混匀后，静置一个小时形成免疫复合物；。与常规的ELISA方法相比，本方法为抗VEGF单抗与FcγRI(CD64)结合活性的评估提供了一种新的分析方法。

本发明优选的技术方案中，抗VEGF单抗与抗原的摩尔比在0.1～10:1之间；优选地，所述抗VEGF单抗与抗原的摩尔比在0.5～5:1之间，更优选地，抗VEGF单抗与抗原的摩尔比在1～3:1之间。