[发明专利]猪胎儿成纤维细胞冻存液

说明书

本发明属于细胞保存技术领域，具体涉及一种猪胎儿成纤维细胞冻存液。该猪胎儿成纤维细胞冻存液包括以下组分：蔗糖、乙二醇、二甲基亚砜和DMEM基础培养基。本发明的细胞冻存液质量稳定，能够很好的解决由于血清品质差异导致的冻存效果不稳定难题。该细胞冻存液能够很好的缓解冻存过程中冰晶对细胞的伤害，复苏后的细胞活力达90％，电转后细胞形态和增殖活力良好，且该细胞冻存液成本低。

技术领域

本发明属于细胞保存技术领域，具体涉及一种猪胎儿成纤维细胞冻存液。

背景技术

猪的器官大小、生理、代谢、寿命及疾病发生机理等都与人有较大的相似性，相对于非人类灵长类动物而言，猪没有苛刻的伦理道德和动物保护方面的要求，加上繁殖力高，饲养成本低，猪已成为人类疾病研究的理想动物模型。许多疾病难以通过自发或人工定向培育的方法获得疾病研究的相关动物模型。基因编辑技术的出现，为人类精确地研究基因与疾病的相关关系提供了可能。目前，猪的胚胎干细胞一直没有建立相应的干细胞数据库，也没有国际公认的诱导性多能干细胞(IPS)用于基因操作，目前制备基因修饰猪应用最广泛的是猪胎儿成纤维细胞。正常的猪胎儿成纤维细胞在体外培养时会不停生长分裂从而导致最终衰老和凋亡。为了保护及合理有效利用细胞资源，人们需要将细胞种子资源保存起来以供日后使用。

目前，猪胎儿成纤维细胞保存普遍采用低温冷冻。低温冻存需要添加冷冻保护剂，如果直接冷冻，细胞内会产生冰晶对细胞造成伤害，从而导致细胞死亡。血清能稳定细胞膜、缓冲和保护细胞，调整细胞内渗透压，减少在冻存和长期储存过程中的活性氧自由基对细胞造成伤害，是猪胎儿成纤维细胞冻存常用的保护剂，使用血清来冻存，细胞存活率高，效果好。但血清价格昂贵，且不同来源血清所含促细胞因子、促贴附因子、激素以及其他活性物质等组份与比例不同，市场上销售的血清鱼龙混杂，不同品牌血清质量差异大，即使是同一品牌，也存在不同批次之间的差异。因此猪胎儿成纤维细胞冻存液中血清的质量常常制约着复苏后细胞的活力与增殖能力，尤其是在制备基因修饰猪过程中，复苏后的细胞必须具有稳定的增殖活力，才能经受后期的转染与筛选。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种猪胎儿成纤维细胞细胞冻存液。

除特殊说明外，所述百分比均为体积百分比。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种猪胎儿成纤维细胞冻存液，包括以下组分：蔗糖、乙二醇、二甲基亚砜和DMEM基础培养基。

所述DMEM的英文全称为dulbecco's modified eagle medium，中文译名为改良杜氏伊格尔培养基，是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的。与MEM比较增加了各种成分用量。

发明人意外发现，将以上冻存液用于猪胎儿成纤维细胞冻存，能够在细胞冷冻的初始阶段使细胞脱水，从而减少冷冻降温过程中胞内冰晶形成从而保护细胞不受冷冻损害。

进一步，所述蔗糖的终浓度为0.1-0.5mol/L。

进一步，所述乙二醇的体积分数为15-25％，二甲基亚砜的体积分数为15-25％，DMEM基础培养基的体积分数为50-70％。

发明人意外发现，按照上述比例配比，冻存液能够穿过猪胎儿成纤维下拨的细胞膜渗透到细胞内，增大胞内渗透压，降低冰点，延缓冻存过程。

在依据本发明的冻存液中，本领域技术人员还可根据具体的使用要求，在本发明的冻存液中添加白蛋白、海藻糖、丙二醇、糖酐、维生素C、脯氨酸等冷冻保护剂。上述白蛋白、海藻糖、丙二醇、糖酐、维生素C、脯氨酸等冷冻保护剂于本领域普通技术人员而言是清楚的概念。

本发明的目的之二在于保护所述冻存液的制备方法，包括以下步骤：取蔗糖浓储、乙二醇、二甲基亚砜以及适量DMEM基础培养基，配制成冻存液；