[发明专利]测定大鼠血浆生物样品中的DTPA-Zn的方法

权利要求书

1.测定大鼠血浆生物样品中的DTPA-Zn的方法，该方法使用液相色谱-串联质谱法测定经处理的大鼠血浆生物样品中的DTPA-Zn的含量，包括如下步骤：

(1)生物样品的处理：

(1a)取含有或不含有DTPA-Zn的大鼠血浆50μL，置于1.5mL离心管中，加内标溶液即25μg/mL的EDTA-Zn水溶液10μL或者不加内标溶液，0.1%氨水50μL，水400μL，涡流混合3min，全部上样于固相萃取小柱上；

(1b)上样后依次用1mL水、1mL甲醇清洗，最后用含5%氨水的甲醇1mL洗脱；

(1c)收集该洗脱液，吹干，用含0.05%氨水的50%甲醇150μL复溶，吸取20μL进行LC-MS/MS分析；

(1d)标准曲线的制备：取不同浓度的DTPA-Zn标准系列溶液分别加至空白大鼠血浆中，配制成相当于浓度为1、2、5、10、20、50、100、和200mg/mL的标准曲线血浆样品；取该血浆样品50μL，依次加入内标溶液10μL，0.1%氨水50μL，水400μL，涡流混合3min，全部上样于固相萃取小柱上，接着照以上(1b)和(1c)操作，根据LC-MS/MS分析结果绘制标准曲线，该标准曲线用于计算各种样品中的目标物质含量；

(2)液相色谱-串联质谱测定：

(2a)提供高效液相色谱仪和串联质谱仪，所述高效液相色谱仪配备梯度泵和进样器，所述串联质谱仪配备电喷雾离子源和数据处理系统；

(2b)色谱条件：所用的分析柱为SHISEIDO Proteonavi品牌的色谱柱，其规格为5μm，250×4.6mm I.D.，柱前连接C₁₈保护柱，其规格为4´3.0mm I.D.，柱温25℃，流动相为体积比50:50的甲醇-2mM甲酸铵，流动相中含0.03%氨水，流速0.45mL/min；

(2c)质谱条件：电喷雾离子化源，使用Turbo Ionspray源，负离子方式检测；喷射电压为-4000V；源温度为400℃；卷帘气为20；碰撞气为4；扫描方式为多反应监测，用于定量分析的离子反应分别为：Zn-DTPA的m/z 226.6 ® m/z 204.5且其CE为-15V和内标EDTA-Zn的m/z 444.2 ® m/z 319.2且其CE为-34V，扫描时间为150msec；

(3)数据处理与分析

(3a)通过上述液相色谱-串联质谱测定得到生物样品中的目标物质含量；和，任选的

(3b)用非房室模型计算选自下列的一下或多个药动学参数：C_max、T_max、t_1/2、MRT、AUC_0-t、V_z、CL；其中，C_max为实测的最大血药浓度，T_max为口服给药后血药浓度达峰时间，t_1/2为药物末端消除半衰期，MRT为药物在体内平均滞留时间，血药浓度-时间曲线下面积AUC_0-t由梯形法计算得到，V_z为稳态时表观分布容积，CL为清除率；以及，任选的

(3c)计算给药的生物利用度：在等当用药剂量下，用第二给药方式所得AUC值除以第一给药方式所得AUC值再乘以100%所得百分数，作为第二给药方式相对于第一给药方式的相对生物利用度。

2.根据权利要求1的方法，其中所述大鼠血浆是从给予或未给予Zn-DTPA的大鼠静脉血置于含肝素钠的离心管中，2000~4000g离心10~30min获得的血浆。

3.根据权利要求1的方法，其中所获得的大鼠血浆任选的被置于-20℃冰箱中冻存，以等待测定。

4.根据权利要求2的方法，其中所述大鼠静脉血是从大鼠眼眶静脉窦采血获得的。

5.根据权利要求1的方法，其中所用的内标为EDTA-Zn Na₂·xH₂O。

6.根据权利要求1的方法，其中所述固相萃取小柱在上样前，先用1mL甲醇活化，再用1mL水平衡。