[发明专利]大鼠抗p16蛋白的单克隆抗体的制备

说明书

本发明涉及生物技术领域，公开了一种杂交瘤细胞株（R3C7），以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。本发明所述单克隆抗体可与p16蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了p16蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可以识别人p16蛋白质分子的大鼠单克隆抗体及其制备方法。

背景技术

人细胞周期依赖性激酶抑制基因（CDKN2A）为抑癌基因，编码两种不同的细胞周期抑制蛋白p16INK4a和p14ARF。p16INK4a简称p16，是由外显子1α、2和3编码。P16分子定位于细胞核及细胞质，能特异性的结合细胞分裂周期关键酶CDK4或CDK4与细胞周期素（Cyclin）的复合体，参与G1-S转换的调控，抑制CDK4的活性，阻止细胞进入S期，对RB基因控制的细胞增殖周期中起负调节作用。由于p16参与调控细胞周期的作用，所以其在肿瘤发生过程中也发挥着重要作用。多项研究表明，p16表达量的变化及突变的发生与肺癌、肝癌、恶性胶质瘤、黑素瘤、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌等多肿瘤的发生相关。

目前临床上主要通过免疫组织化学（IHC）病理实验检测肿瘤组织中p16蛋白的表达状况。IHC实验的核心为特异性结合p16蛋白的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对p16蛋白的单克隆抗体具有重要的意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种抗p16蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗p16单克隆抗体。本发明所述大鼠单克隆抗体可与p16蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了p16蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，真实反映肿瘤细胞内p16蛋白表达水平。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明对p16分子，按照公开的序列进行分析，依据在细胞内的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择适宜可溶表达又具有良好免疫原性的区域用于重组表达。经基因合成后克隆进表达质粒载体pET-28a中进行重组表达，分离纯化表达产物的可溶部分进行亲和纯化后作为免疫原，免疫Wistar大鼠。经细胞融合、重组p16筛选克隆，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系。

利用该杂交瘤细胞系用Wistar大鼠进行腹水制备，亲和层析纯化腹水，获得大鼠单克隆抗体。用ELISA技术测定该单克隆抗体的亚类为IgG1型单克隆抗体，亲和常数为1.94×10⁹。免疫印迹（Western blotting）实验显示该抗体能特异识别重组p16蛋白以及表达p16分子的肿瘤细胞。

为达到上述目的，本发明的具体技术方案如下：

所述抗p16单克隆抗体由大鼠杂交瘤细胞系R3C7分泌。

获得所述抗p16单克隆抗体时免疫大鼠用的抗原为重组p16抗原蛋白，所述重组p16抗原蛋白经大肠杆菌重组表达而获得。

所述重组p16抗原蛋白包括以下一个或几个部分：具有抗原性的p16片段和用于纯化重组蛋白的标签蛋白。

所述p16片段为411-750位氨基酸蛋白序列，所述蛋白标签为6个组氨酸。

所述抗p16单克隆抗体为大鼠IgG1亚型单克隆抗体。

所述抗p16单克隆抗体能够识别重组p16抗原蛋白和肿瘤细胞内的p16分子。

制备以上所述的抗p16单克隆抗体的方法，包括以下几步：