[发明专利]一种动物角膜长期培养评价眼刺激性损伤及修复的方法

说明书

一种利用动物离体角膜长期培养模型评价眼刺激性损伤及修复作用评估的方法，包括以下步骤：1.离体角膜制备；2.角膜长期培养；3.角膜化学损伤模型及评价；4.角膜物理损伤模型及评价；5.角膜损伤后修复作用评估；6.统计分析与结果判定。本发明利用外源刺激物，如化学物质、紫外线引起可逆性的角膜上皮细胞变性和基质损伤，通过预测模型，评估眼刺激性的程度；或者是利用化学方法、物理方法或机械方法造成角膜上皮细胞和基质的可逆性刺激、轻微磨损或缺失损伤，评估损伤后角膜的自身修复，或者损伤发生后添加药物评价药物促进角膜修复作用的方法。本方法操作简单，与体内实验相关性好，敏感程度高，能满足角膜刺激性损伤及其修复的检测和研究的需要。

技术领域

本发明涉及一种应用于化学品、化妆品、农药和药品眼刺激性及恢复的毒理学和药理学实验评价的利用动物如猪或牛等离体角膜长期培养模型评价眼刺激性损伤及修复作用评估的方法。

背景技术

许多外源化学物质，如化妆品、药品、农药和大气污染物等，有可能会接触到眼睛造成人体眼睛的健康危害。所以，检测和评估药品、日用消费品(如个人护理品、家居化学品、清洁消毒产品等)、环境污染物(如农药、烟尘、颗粒物、花粉等)潜在眼刺激性成为保障人身安全的重要内容。眼刺激试验是眼部接触产品上市前安全评价的强制检验项目，也是化学品标识和分类的强制要求，其目的是采用科学方法检测和判断产品安全性以减少人类健康风险。因此对待测物的快速分类和危害识别是风险决策的首要任务。对于眼刺激物的毒理学评价，传统方法沿用1944年Draize提出的兔眼刺激体内实验，兔眼实验的缺点包括动物遭受极大痛苦、试验周期长、检验成本高、结果判定主观性强、动物与人体反应存在差异等。

另一方面，临床常见的角膜外伤性或机械性损伤的治疗，或手术后(如角膜异物剔除术后、准分子术后或白内障术后)通常需要使用一些药物促进角膜愈合，对这些药物是否具有刺激性，及其促进角膜修复作用的观察也是药理研究的基本要求。传统的评价方法通常使用活体动物，造成角膜缺损或刺激性损伤模型，然后通过施加药物后检查角膜形态、结构和功能，评估药物的作用。动物实验普遍存在动物极其痛苦、试验周期长、手术稳定性差、研究成本高、与人体反应存在差异等不足。

随着生命科学研究和检验检测中“3R原则”，即减少(reduction)、代替(replacement)和优化(refinement)动物实验原则的国际化，特别是“21世纪毒性测试愿景”的提出和新技术的发展，不再以动物模式为基础的测试系统已成为科学研究的热点，一些检测和评估的方法已被许多国家的法规所接受。如欧盟化妆品法规《1223/2009/EC》对于化妆品动物实验的禁止，欧盟化学品REACH法规《1907/2006/EC》 (化学品的注册、评估、许可和限制)鼓励动物试验替代方法的开发和应用。采用体外实验系统和方法进行眼刺激性评价已取得极大成功，对于急性刺激和腐蚀性的测试，经济合作的发展组织(OECD)已确认和认可了一些方法，包括离体牛角膜的方法，角膜细胞的短期暴露方法，上皮细胞的荧光素漏出法和重建角膜模型的方法等。如何合理科学地使用这些方法，并在此基础上进一步创新新的测试系统和评估方法，解决现有方法和不足，仍然是眼科毒理学和药理学评价的主要研究内容。

根据体内眼损伤发生的机理，目前开发中的眼刺激替代方法可分为细胞系统、鸡胚、人工角膜和离体器官四类，这几类方法各有其优缺点和适用范围。细胞系统标准化程度最高、成本低、快速，但只适用于可溶解物质的测试。鸡胚方法的标准化程度不高，适合模拟结膜的损伤，而对角膜损伤预测不佳。体外重建的人工角膜缺少角膜内皮细胞层、构建成本高，操作难度大。而且，上述这些方法都不能用于角膜损伤后恢复作用的研究和测试，因为有些轻微刺激性的物质可造成角膜的短暂可逆性损伤，只有体外培养时间较长的试验系统才能检测这种作用。此外，对于各种原因导致的角膜机械性损伤，如角膜上皮擦伤(如指甲、树枝、隐形眼镜等异物划伤)、角膜异物伤(如铁屑、谷壳、风沙、灰尘等)、角膜手术(如激光治疗近视眼、微创切除)，也需要开发促进角膜修复的药物并研究其作用机制。而采用单层细胞培养、鸡胚培养或人工角膜等体外方法均不能模拟角膜的完整结构和机械性损伤。