[发明专利]一种大规模生产高纯度猪圆环病毒ORF2蛋白的方法

说明书

本发明属于疫苗制备技术领域，具体涉及一种大规模生产高纯度猪圆环病毒ORF2蛋白的方法。所述方法包括：取猪圆环病毒ORF2蛋白培养液，加入少量壳聚糖摇匀后自然沉降，吸取上清利用中空纤维柱澄清过滤，再利用离子交换柱进行离子交换，洗脱液经G25层析柱脱盐、除菌过滤后，即得高纯度猪圆环病毒ORF2蛋白液。本发明通过化学试剂沉降，澄清过滤，离子交换，层析柱脱盐等工艺，实现了大规模(500L～1000L)高效生产制备高纯度猪圆环病毒ORF2蛋白，高纯度猪圆环病毒ORF2蛋白的回收率可达99.46％，杂蛋白去除率高达98.04％，有效抗原含量高达93.2％。

技术领域

本发明属于疫苗制备技术领域，具体涉及一种大规模生产高纯度猪圆环病毒ORF2蛋白的方法。

背景技术

猪圆环病毒2型(PCV₂)含有2个主要的开放阅读框，其中ORF2基因编码的病毒衣壳蛋白是主要结构蛋白，包含主要的抗原中和表位，具有良好的免疫原性，且PCV₁和PCV₂之间不发生血清学交叉反应，是检测病毒抗体水平的良好抗原，也是发展新型疫苗的良好靶基因。利用杆状病毒表达系统在体外表达重组ORF2蛋白(28kDa)能够自我组装为病毒核衣壳样粒子，并表现出良好的免疫原性。圆环病毒ORF2蛋白具有PCV₁和PCV₂共同的免疫原性，是现在疫苗的趋势。

目前，针对圆环病毒的常规纯化方法主要采用抗原离心、死端过滤、膜包浓缩等方式，操作复杂，成本昂贵，并且以常规生产工艺流程制备的圆环病毒灭活疫苗在临床应用中有一定的副反应，主要与疫苗中所含的抗原外成分有关。这些成分包括：病毒培养用细胞的残留蛋白质和残留DNA；培养基残留如小牛血清；灭活剂残留；防腐剂(如硫柳汞)等。这些异源成分不仅会引起免疫动物的副反应，而且会大大降低疫苗的效力。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种大规模生产高纯度猪圆环病毒ORF2蛋白的方法。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种大规模生产高纯度猪圆环病毒ORF2蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取猪圆环病毒ORF2蛋白培养液，加入壳聚糖摇匀后自然沉降，吸取上清作为待澄清蛋白液；

(2)将步骤(1)所得待澄清蛋白液利用中空纤维柱澄清过滤，得到猪圆环病毒ORF2蛋白澄清液；

(3)将步骤(2)所得猪圆环病毒ORF2蛋白澄清液利用离子交换柱进行离子交换，随后洗脱，得到猪圆环病毒ORF2蛋白纯化洗脱液；

(4)将步骤(3)所得的猪圆环病毒ORF2蛋白纯化洗脱液利用G25层析柱脱盐，洗脱后得到猪圆环病毒ORF2蛋白纯化液；

(5)步骤(4)所得蛋白纯化液除菌过滤后，即得高纯度猪圆环病毒ORF2蛋白液。

上述方案中，步骤(1)中所述壳聚糖的加入量为猪圆环病毒ORF2蛋白培养液质量的1％～10％，更为优选地，所述壳聚糖的加入量为5％。

上述方案中，步骤(2)所述中空纤维柱的孔径为0.2μm～0.65μmm，更为优选地，所述中空纤维柱的孔径为0.2μm。

上述方案中，步骤(2)所述中空纤维柱的型号为：CFP-2-E-55；所述中空纤维柱的设备型号为VERSAFlux 120。