[发明专利]一种阳离子多肽纳米聚集体及在抗菌方向的用途

说明书

技术领域

本发明属于抗菌肽制备与应用领域，具体涉及一种基于阳离子多肽纳米聚集体的制备与抗菌方向的应用。

背景技术

青霉素在细菌感染中的应用,使人们摆脱了细菌感染死亡的威胁。随后,越来越多的抗生素被人们发现并应用于医疗中。然而抗生素的快速发展虽然为人类的健康做出了卓越的贡献,但它却是一把双刃剑,如今随着抗生素的过度使用，细菌的耐药性问题也越来越严重。特别是医药领域抗生素的使用，使得抗生素的效果越来越弱，近年来更是因“超级耐药菌”的出现，严重威胁着人类的健康。由此研究新型抗菌剂取代传统抗生素，解决耐药性的问题迫在眉睫。

抗菌肽(Antimicrobial Peptides,AMP_S)，其广泛存在于细菌、植物、动物中,在生物体内由特定基因编码产生的一类两亲性带正电荷的小分子多肽(氨基酸数目一般12-50),是天然免疫防御系统的一个重要组成部分,被称为“第二防御体系”。重要的是抗菌肽具有其独特的杀菌机理,多数抗菌肽在溶液中带正电，而细菌细胞膜带负电，抗菌肽通过静电吸附于细胞膜，破坏膜结构，这样使细菌不易产生耐药性。因而抗菌肽有希望替代传统抗生素,成为新一类的杀菌药物。同时，抗菌肽的应用也将为食品，医药，生物等领域带来一场“绿色革命”。

目前抗菌肽与细菌的作用机理主要认为与其本身的两亲性结构以及正电性有关。多肽链段的N端一般富含阳离子型的氨基酸,且是亲水氨基酸,C端一般富含疏水氨基酸,因此抗菌肽通常具有两亲性和正电性。为获得理想的抗菌肽，在对其进行分子设计时，必须考虑到正电性和两亲性两个特点。抗菌肽所带的正电荷与微生物细胞膜的负电荷相互吸引，最终使抗菌肽接近微生物细胞膜表面。抗菌肽接近微生物细胞膜后，其亲水端与磷脂分子层(细胞膜骨架)亲水端接触，进而将疏水端插入磷脂分子层的疏水内部，干扰细胞膜的通透性。在这两种机制下，抗菌肽最终破坏微生物细胞膜，使微生物死亡。

传统的抗菌肽在溶液中通常以单体与细菌相互作用，而单体在生理环境下容易被降解丧失一定的抗菌效果，而聚集体结构的抗菌肽在溶液中更稳定，相比单体，也不易被降解，因此开发新型抗菌肽使其自组装为聚集体结构成为目前研究的热点。

人类淀粉样多肽Aβ_16-22(KLVFFAE)，包含疏水核心LVFF，在一定环境溶液中，能够在溶液中自组装为纤维或两端修饰后能自组装为纳米管。根据这段序列，将其中的亲水性氨基酸-丙氨酸(A)和谷氨酸(E)都替换为赖氨酸(K)，亮氨酸(L)和缬氨酸(V)都替换为苯丙氨酸(F),综合设计了两亲性多肽序列KKKFAFAFAFAKKK和KKKFAFAFAFAKKK，两段多肽在溶液中带正电荷(PH＝1～10，电位图见图2)，使其具备抗菌肽特征，又同时具备自组装的能力。

发明内容

制备阳离子多肽纳米聚集体，并用于光热杀菌。该纳米聚集体结构比较稳定，不易被降解，与细菌相互作用强，可在短时间内杀死细菌。

本发明的技术方案如下：

一种阳离子多肽纳米聚集体的杀菌应用，按照下述步骤进行：

将50μL细菌悬浮液(～5×10⁶cfu mL^–1)分别加入2mL阳离子多肽的纳米聚集体溶液中，置于37℃恒温培养箱培养，每隔1h，用磷酸盐缓冲液稀释10000倍，取100μL稀释后的悬浮液放到Lysogeny Broth固体培养基，在37℃培养18h，计算菌落数。

上述技术方案中所述的阳离子多肽纳米聚集体，其制备方法如下：

将浓度为80～480μg mL^–1的阳离子多肽加入(pH＝6.5～8.5)的溶液中，并置于恒温振荡器上孵育30～60min(35～38℃，360rpm)，阳离子多肽自组装后形成纳米聚集体。

上述方案中所述细菌为大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌(salmonella)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中的一种。