[发明专利]一种基于糖蛋白非糖肽的质谱多反应监测定量糖蛋白方法

说明书

本发明属分析化学技术领域，涉及糖蛋白质谱相对/绝对定量的方法，具体涉及一种基于糖蛋白非糖肽的质谱多反应监测定量糖蛋白方法，其包括：利用肼化学法对样品中的糖蛋白进行富集，用蛋白酶释放糖蛋白的非糖肽，利用色谱‑质谱鉴定技术对非糖肽进行鉴定，合成适用于MRM定量的标准肽段，然后对这些肽段的保留时间，能量，母子离子对进行质谱优化，并建立相应的数据库；并将肽段可用于样品中糖蛋白的绝对/相对定量。本发明方法步骤简单、操作方便、快速高效，可以实现糖基化的单个蛋白质/糖蛋白质组的快速、精准定量。

技术领域

本发明属分析化学技术领域，涉及一种糖蛋白质谱相对/绝对定量的方法，具体涉及基于糖蛋白上不含糖基化位点的肽段(非糖肽)，利用质谱多反应监测定量糖蛋白的新方法。

背景技术

现有技术公开了蛋白质糖基化是生物体内最复杂、最重要、也是最普遍的后修饰之一。蛋白质的糖基化修饰在生物体起着极其重要的作用。研究显示，蛋白质糖基化水平异常变化不仅影响着糖蛋白的生物功能，还与许多疾病密切相关，如，FDA认证的癌症标志物中有25％是糖蛋白。可见，高效、准确的定量不同生理状态下的糖蛋白的变化，对于疾病机制研究及临床检验都有着重要的意义。

由于蛋白质糖基化具有宏观、微观不均一性，丰度低，离子化效率低，质谱检测困难等特点，使得对其定量存在着很大的技术挑战。近年发展的质谱多反应监测技术(MRM-MS)被认为是一种快速、高特异性、高准确性的质谱定量技术。还有研究将MRM用于糖蛋白定量的技术，如单个完整糖肽定量技术，岩藻糖修饰的肽段定量技术等。虽然MRM在糖蛋白质组定量中显示出了一定的优势和潜力，但是糖蛋白的MRM定量分析仍然存在很大挑战：由于糖蛋白含有N-糖基化位点的肽段仅有5％，限制了用于糖蛋白定量的肽段的选择；以及由于糖肽存在高度异质性，会影响定量结果的准确性。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种基于非糖肽的MRM糖蛋白的定量方法，本方法能解决MRM技术在糖蛋白定量方面的困难，在糖蛋白质组学、糖生物学、生物医学、临床研究等领域具有着良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提出一种准确、高效的糖蛋白相对/绝对定量方法，具体涉及一种基于糖蛋白非糖肽的质谱多反应监测定量糖蛋白方法。本方法中利用肼化学法对样品中的糖蛋白进行富集，用蛋白酶释放糖蛋白的非糖肽，利用色谱-质谱鉴定技术对非糖肽进行鉴定，合成适用于MRM定量的标准肽段，然后对这些肽段的保留时间，能量，母子离子对进行质谱优化，并建立相应的数据库；并将肽段可用于样品中糖蛋白的绝对/相对定量。

具体的，本发明提出的糖蛋白相对/绝对定量方法，是采用质谱多反应监测技术，对糖蛋白的非糖肽进行定量，从而实现对糖蛋白的相对/绝对定量的方法；它包括以下步骤：首先用肼化学法特异性的富集样品中的糖蛋白；然后利用蛋白酶释放糖蛋白的非糖肽(糖蛋白上不含糖基化位点的肽段)；再用色谱-质谱技术对这些非糖肽进行鉴定；并挑选可用于质谱多反应监测分析的非糖肽，合成标准非糖肽；利用质谱多反应监测技术对这些标准的非糖肽进行质谱优化；对这些非糖肽进行MRM定量分析，从而实现样品中糖蛋白质的相对/绝对定量。

本发明提出的基于糖蛋白MRM定量的方法，基于糖蛋白上不含糖基化位点的肽段，给可用于MRM分析的肽段提供了更多选择的可能性，避免了糖肽分析的限制性；同时避免了糖基化的微观不均一性以及多糖基化位点的糖肽对定量结果准确性产生的影响。

更具体的，本发明的一种基于糖蛋白非糖肽的质谱多反应监测定量糖蛋白的方法，其特征在于，采用肼化学法及串联质谱法鉴定糖蛋白上的非糖肽，其中，对所述非糖肽进行挑选并合成标准肽段，利用质谱多反应监测技术对所述非糖肽进行质谱定量条件优化后，实现所述非糖肽的糖蛋白质的相对/绝对定量；其包括步骤：

(1)用肼化学法特异性的富集样品中的糖蛋白；

(2)用蛋白酶释放糖蛋白的非糖肽，所述的非糖肽为糖蛋白上不含糖基化位点的肽段；