[发明专利]一种液体即用型凝血酶原时间检测试剂

说明书

技术领域

本发明属于生物医学诊断技术领域，具体涉及一种液体即用型凝血酶原时间检测试剂及制备方法。

背景技术

血凝系统是由多个因子来参与调控的，血凝系统的激活主要分为内源性途径和外源性途径。组织因子参与外源性途径的激活。组织因子(TF)是一种膜蛋白，当血管受损时，TF释放出来，与因子VIIa形成VIIa/TF复合物，VIIa/TF复合物激活FX因子变成有活性的FXa，FXa激活FII因子变成有活性的FIIa(凝血酶),凝血酶分解纤维蛋白原变成纤维蛋白，最终形成血块。凝血因子的减少或缺失可引起血凝系统疾病，如出血，血栓等疾病。引起凝血因子的减少或缺失的原因很多，有先天遗传的因素和后天获得的因素造成。在临床实践过程中，经常需要对患者的凝血系统功能进行监测，例如：手术，抗凝及溶栓治疗。凝血功能的检测对于临床各科的疾病诊断具有很大的意义。凝血酶原时间(PT)是检查外源性途径凝血因子是否异常的一个筛选试验，主要监测凝血因子I、II、V、VII、X的水平。PT仍然是检查外源凝血系统诸因子及相关抑制物的重要筛选试验，是目前口服抗凝剂治疗的主要监测手段，也是外科手术前病人凝血功能的一项重要检査指标。

凝血酶原时间(PT)检测试剂的主要成分是由组织因子和磷脂。组织因子主要是从兔脑组织提取(如上海太阳公司的PT试剂)和人胎盘提取(如Dade Behring公司的PT试剂)。从兔脑提取的组织因子实际上是组织因子和磷脂的复合物，已经含有磷脂，不需要加入磷脂直接可以用来制备PT试剂。现在大部分的PT试剂都使用从兔脑组织提取组织因子和磷脂来制备。由于兔脑组织中的组织因子和磷脂含量受诸多因素的影响，比如兔的年龄，性别，成长的季节，饮食等均对组织因子的含量以及磷脂的成分和含量有很大的影响。不同的磷脂成分，不同磷脂成分的不同含量，组织因子和磷脂之间的不同比例对PT试剂的检测效果具有很大的影响。使用不同批次的兔脑粉提取组织因子和磷脂，所得的组织因子和磷脂含量差异很大。即使利用同一批次的兔脑粉，利用不同的提取方法，所得的组织因子和磷脂含量也产生很大差异。因此利用兔脑粉来制备的PT检测试剂批间差很难控制。这也是不同公司的PT试剂的临床检测结果不能通用的原因。每个公司的PT试剂的生产工艺不同，所用的兔脑粉来源以及组织因子和磷脂的提取方法不同，不同公司生产的PT试剂对同一个样品测定的结果是不一样的。中国专利CN1952169B公开了一种临床检验凝血酶原时间(PT)测定体外诊断试剂盒，是由组织因子，磷脂和缓冲液体系组成。该发明利用兔脑粉提取组织因子和磷脂制备PT试剂，该试剂为冻干粉试剂，灵敏度不高，批间差难以控制。为了解决批间差的问题，现有技术中利用重组因子取代天然的组织因子，解决了在从天然组织中提取组织因子和磷脂时，所得的组织因子含量不同的问题。中国专利CN101294163B利用基因工程的方法在酵母中表达制备人重组组织因子，再将组织因子和从SIGMA购买的从黄豆中提取的磷脂复合物混合重新脂化，将组织因子嵌合到脂质体的磷脂双分子层表面制备脂化的组织因子。利用脂化的组织因子制备PT试剂。尽管该试剂是液体试剂，解决了组织因子浓度不同引起的批间差问题，但由于天然来源的磷脂混合物组分不明确，而且磷脂组分的组成以及各组分的含量在不同的批次差异很大，因此还没有解决由于天然磷脂内在的不可避免的缺陷引起的批间差问题，而且利用人重组因子制备PT试剂特异性不是很高。中国专利CN102565427A公开了一种利用重组牛或羊的组织因子以及合成磷脂制备PT试剂的方法，将基因工程的方法制备纯度在90％以上的牛或羊组织因子的溶液加入含有磷脂和表面活性剂的磷酸缓冲液中，得到磷脂/组织因子溶液后加入烷基键合硅胶，离心分离，滤除沉淀，取上清液冻干，即得所述的凝血酶原时间测定试剂。该发明在制备过程中利用Triton-X-100溶解磷脂，由于少量的Triton-X-100对PT的检测有很大的影响，因此需要将Triton-X-100去除干净。该技术方案中无法仅通过透析去除Triton-X-100，需要使用烷基键合硅胶对磷脂/组织因子溶液进行纯化，制备步骤繁杂，并且增加了生产成本。此外，由于液体中磷脂/组织因子溶液的稳定性较差，该方法对溶液进行了冻干处理。冻干粉制剂虽然具有稳定性好，保质期长，便于运输等优点，但冻干粉试剂需要冷冻干燥工序，生产起来比较复杂，而且在使用时需要复溶。冰冻干燥首先将试剂分装到各小瓶的试剂瓶里，然后再将装有试剂的瓶子放到冰冻干燥机进行冰冻干燥。由于在分装时会产生差异，且冰冻干燥过程中，各瓶冰冻干燥效果的差异，以及复溶过程中，加复溶剂量的不同引起的浓度差异，所有这些差异使得冻干粉制剂瓶间差，批间差变化很大。

发明内容