[发明专利]体外诱导多能干细胞分化为心室肌细胞的方法

说明书

本发明提供体外诱导多能干细胞分化为心室肌细胞的方法，其是通过在体外维持、扩增、培养多能干细胞，在多能干细胞心肌分化的中期即由中胚层细胞或心肌前体细胞向心肌细胞分化的时期，向培养基中加入可直接或间接激活Smad1/5/8信号通路的物质，使干细胞定向分化为心室肌细胞。利用本发明方法，成功获得了具有生物学活性及功能的心室肌细胞，不仅揭示了心肌前体细胞向心室肌细胞分化过程中的调节机制，而且分化得到的人心室肌细胞对细胞移植治疗心肌梗死和心脏毒理分析及心脏相关药物的研发有广泛的应用。

本发明是国际申请号PCT/CN2013/079811的PCT发明专利申请，优先权日为2012年7月23日，国家阶段申请号为2013800394581，发明名称为“体外诱导多能干细胞分化为心室肌细胞的方法”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及多能干细胞分化及细胞信号转导领域，具体地说，涉及体外诱导多能干细胞分化为心室肌细胞的方法。

背景技术

对于人类和哺乳动物而言，心肌细胞在出生前具有分裂增殖的能力，而出生以后，这一能力迅速降低。成年人的心肌细胞几乎不具备分裂增殖的能力。在发生诸如心肌梗塞等心脏组织坏死性疾病时，由于成体心肌细胞已失去增殖分裂的能力，不能通过心肌细胞的再生来修复坏死的组织，所以这类疾病引起的心脏功能衰退是不可逆转的。虽然可以通过药物的使用增加心肌收缩力，提高心脏的泵血能力，但心脏负担的加重反而可能使病情恶化。用正常的心肌细胞移植替换已经坏死的细胞是从根本上治疗这类心脏病的方法之一。因为成体心肌细胞几乎已失去分裂增殖能力，寻找人心肌细胞的来源成为目前再生医学治疗心肌梗塞首要解决的问题。

多能性干细胞(Pluripotent stem cells)，如胚胎干细胞(embryonic stemcells)¹、诱导的多能干细胞(Induced Pluripotent Stem cells，iPSC)^2,3，不但具有较强的自我复制能力,而且还具有分化成心肌细胞的潜能。因此，例如胚胎干细胞的多能干细胞是目前最具潜力的心肌细胞来源，而建立高效的，心肌细胞定向分化方法是获得心肌细胞的关键。

利用多能干细胞如胚胎干细胞，诱导分化心肌细胞一般包括两种方法：一种是悬浮培养胚胎干细胞，使其形成胚状体(embryoid body)进而继续分化成心肌细胞；另一种方法是直接诱导一般培养条件下的单层贴壁胚胎干细胞，使其向心肌细胞分化。已有文献报道多种细胞因子具有提高心肌分化效率的作用，其用量及作用时间因不同的诱导分化体系而异。

人的多能干细胞分化的心肌细胞主要分为三类：起搏细胞(Nodal cell)、心室肌细胞(Ventricular myocytes cell)和心房肌细胞(Atrial myocyte cell)⁴。完全成熟的心肌细胞根据其功能属性又可分为工作心肌细胞和自律性的起搏心肌细胞两大类。工作心肌细胞的肌原纤维丰富，具有传导性和兴奋性，执行收缩功能。它们是心房和心室壁的主要构成部分，即心房肌细胞和心室肌细胞。具有自律性的起搏心肌细胞丧失了收缩性，但它们和工作心肌细胞一样具有传导性和兴奋性。而且它们还具有独特的自律性。心房肌细胞、心室肌细胞和起搏细胞这三类细胞的胞内肌原纤维的组成以及细胞膜上的离子通道蛋白表达有明显区别，这也就造成它们的动作电位和收缩的节律性有很大差别。对于心肌细胞移植而言，至关重要的是要移植适当种类且纯度较高的单一亚型的心肌细胞。例如，修复心室组织需要移植高纯度的心室肌细胞，这关系到其能否顺利整合到受体心脏、能否真正提高心脏功能和是否能够减少移植细胞所带来的心律不齐等副作用。如果移植细胞种类不匹配或纯度不高的心肌细胞，会造成心律不齐，损害受体的原有心脏功能。由于左心室主要负担全身的血液供给，其体积最大，细胞壁也最厚，泵血能力最强，而心肌梗死导致的心肌细胞坏死也多发于该区域。因此，对于三类心肌细胞来说，获得心室肌细胞对细胞移植治疗心肌梗死具有更为重要的意义⁵。