[发明专利]肝衰竭的血清糖蛋白N‑糖组图谱模型的建立方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种肝衰竭的血清糖蛋白N-糖组图谱模型的建立方法。

背景技术

肝衰竭(liver failure)是由多种因素引起的严重的肝脏损害，导致肝脏本身合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿，临床上会出现以凝血机制障碍、黄疸、肝性脑病、脱水等表现的一组症候群，死亡率极高。欧美国家的肝衰竭主要由药物引起，我国肝衰竭的病因主要是肝炎病毒感染(主要是乙型肝炎病毒HBV)引起。HBV血清学标志物阳性的感染者均可能发生肝衰竭，大量病毒复制导致肝细胞营养耗竭，免疫麻痹是肝损伤前提，其次是药物及肝毒性物质(如乙醇、化学制剂等)导致的肝衰竭。目前肝衰竭的内科治疗尚缺乏特效药物和手段，原则上强调早期诊断、早期治疗，针对不同病因采取相应的病因治疗措施和综合治疗措施，并积极防治各种并发症。肝衰竭患者诊断明确后，应进行病情评估和重症监护治疗。

组织病理学检查在肝衰竭的诊断、分类及预后判定中具有重要价值，但由于肝衰竭患者的凝血功能严重低下，实施肝穿刺具有一定的风险，易引起出血、感染等并发症；同时肝穿刺存在抽样误差，因为肝组织活检中心仅占肝脏的1/20万-1/5万，不能反映整个肝脏病变；患者依存性差，单次病理检查结果不能反映整个肝衰程度。目前，肝衰竭的临床诊断需要依据病史、临床表现和辅助检查等综合分析而确定。肝衰患者一般都会有临床症状，比如黄疸，乏力，腹胀等，还需要通过进一步的检查才能确诊，通常包含：(1)肝炎病毒标准物检测，了解造成肝衰竭的具体病毒类型，如HBV或HCV阳性，则进一步行病毒定量检测，评价病毒复制程度；(2)全血细胞分析，包括白细胞、血色素、血小板、白细胞分类等，了解是否存在脾功能亢进及感染情况；(3)尿常规，包括比重、pH值、尿胆原、尿胆红素等，间接评判黄疸的类型，初步判断机体代谢状况；(4)肝功能，包括ALT、AST、TBIL、ALB、CHE、CHO、PALB等，了解肝功能损害程度及肝脏合并储备能力；(5)超声或CT、核磁，评价肝脏大小、损伤程度及血管、胆管内径，同时除外恶性梗阻性病变。除此之外，对于有慢性肝病史且长期酗酒者还需要做电子胃镜或者是消化道造影来了解静脉曲张、胃黏膜情况。

上述诊断方法都有自身的局限性，需要凭医生的临床经验，联合使用多种诊断方法进行确诊，花费时间长，检查费用高，且不便于开展肝衰的普查，因此急需探索出用于辅助诊断肝衰竭并具有较高灵敏度和特异度的新型无创性指标。

糖蛋白是通过蛋白质的翻译后修饰即糖基化后形成的一类结合蛋白。蛋白质的糖基化(Glycosylation)是一种最常见的蛋白翻译后修饰，是在糖基转移酶作用下将糖类转移至蛋白质和蛋白质上特殊的氨基酸残基形成糖苷键的过程。大多数的糖蛋白都是分泌蛋白，广泛存在于细胞膜、细胞间质、血浆以及粘液中。糖蛋白具有多种生物功能。由于糖蛋白中糖链对于维持机体生物学功能的重要性，糖链的改变有助于阐明炎症、肿瘤细胞对周围组织侵袭及转移等异常生物行为学的分子机理。目前，己经在多种肿瘤中发现了N-糖链的改变。

糖链结构非常复杂，具有微观不均一性，目前糖链结构的分析方法主要包括(1)高效液相色谱法(HPLC)：该方法分辨率高、检测速度快和重复性高，高效液相色谱柱可以反复使用，但是柱效会随着使用次数的增加而变低，且流动相有毒，设备操作需要受过严格培训的专业人才进行，且设备相对昂贵，溶剂需要严格纯化；(2)质谱法(MS)：质谱具有灵敏度高、可获得多种结构信息和适于分析混合物等优点，但是质谱仪器精密，设备操作复杂，且质谱仪价格昂贵，不适合临床上普及推广使用；(3)毛细管电泳法：毛细管电泳成本低、柱效高、灵敏度高、速度快、进样量少、操作简单，但是重复性不高，稳定性不如HPLC。

G-Test检测法(Glycan-Test)是基于DNA测序仪的毛细管微电泳技术(DSA-FACE)，将血清样本中糖蛋白的N-糖链进行荧光标记后，用毛细管微电泳进行分离，通过测量荧光信号得到的N-寡糖链的含量即指纹图谱(简称G-Test图谱)。该检测技术具有灵敏度高、操作简单、微量(2μl血清)、重复性高、稳定性好、高通量(96-孔板)等其他糖链分析技术无法比拟的优点，适用于一般检验科室，可望用于临床推广使用。

发明内容