[发明专利]一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法及通过该方法获得的病毒样颗粒

权利要求书

1.一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于包括，

猪圆环病毒2型Cap重组蛋白包涵体的制备步骤：

将编码Cap蛋白的PCV2-ORF2基因全长DNA或已去掉编码Cap蛋白N’端信号肽碱基序列的PCV2-ORF2 DNA片段插入原核表达载体中，转化大肠杆菌表达菌，诱导表达Cap重组蛋白；Cap重组蛋白以包涵体形式存在细胞质中，破碎细胞取沉淀，然后对沉淀中的包涵体进行纯化；

所述PCV2-ORF2基因全长DNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述PCV2-ORF2 DNA片段序列如SEQ ID NO.2所示；

Cap重组蛋白包涵体变性步骤：

在4℃的条件下，将包涵体溶解于Buffer-S0中，4℃离心，取第一上清液；在0-4℃的条件下，将第一上清液加至Buffer-S1中，充分混合后有蛋白析出，4℃离心取蛋白沉淀；将蛋白沉淀溶解于Buffer-S2中，4℃条件下震荡至少8h，然后离心取第二上清液；测定第二上清液中总蛋白浓度，添加Buffer-S2将第二上清液稀释至蛋白的浓度为20-400μg/mL，得到变性蛋白溶液；

所述Buffer-S0包括20-100mM Tris-Cl，30-100mM NaCl，50-150mM 2-ME，5-7M盐酸胍，pH为11.5-12.5；

所述Buffer-S1包括20-100mM Tris-Cl，30-100mM NaCl，50-150mM 2-ME，pH为8-9；

所述Buffer-S2包括20-100mM Tris-Cl，30-100mM NaCl，50-150mM 2-ME，6-8M尿素，pH为11.5-12.5；

溶液置换及蛋白复性步骤：

在切向流超滤系统中，采用恒体积透析法对变性蛋白溶液进行溶液置换及蛋白复性；以Buffer-RF作为置换液，超滤过程中，中空纤维膜或膜包的孔径为5-8KD；超滤参数为：跨膜压TMP＝4.0-7.0psi，膜通量1.572±0.756LMH，剪切力Shear＝3727-3773S^-1，收集含复性蛋白的一次超滤溶液；

所述Buffer-RF包括20-80mM Tris-Cl，80-200mM NaCl，0.5-2mM ED TA，1-10mM 2-ME，5-10％甘油，3-8％PEG4000，100-300mM L-精氨酸，0.1-0.5％Triton-X100，pH为5.5-6.5；

病毒样颗粒组装和回收步骤：

在2-8℃条件下，将一次超滤溶液加至Buffer-AS中，然后在2-8℃条件下静置6-18h，得到回收溶液；切向流超滤系统中，使用孔径为50KD的中空纤维膜或膜包，以PBS作为置换液对回收溶液进行超滤，浓缩；超滤参数为：跨膜压TMP＝8-13psi，膜通量21.631±4.366LMH，剪切力Shear＝3019-3098S^-1，收集二次超滤溶液，离心取沉淀，得到猪圆环病毒2型病毒样颗粒；

所述Buffer-AS包括100-300mM柠檬酸铵，2-3％异丙醇，4-8％PEG 4000，pH 5-6。

2.如权利要求1所述的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，猪圆环病毒2型Cap重组蛋白包涵体的制备步骤中，对包涵体进行纯化为使用含有2mol/L尿素的缓冲液对沉淀进行洗涤，用质量分数2％的Triton X-100溶液去除包涵体中的膜碎片和膜蛋白。

3.如权利要求1所述的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，Cap重组蛋白包涵体变性步骤中，第一上清液与Buffer-S1的体积比为1:5-20。

4.如权利要求1所述的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，病毒样颗粒组装和回收步骤中，利用蠕动泵，泵速20～50mL/min条件下将一次超滤溶液加至Buffer-AS中，一次超滤溶液和Buffer-AS的体积比为1:15-25。

5.一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒，其特征在于，通过权利要求1所述的方法制备得到。