[发明专利]一种南瓜抗坏血酸氧化酶的提取纯化方法

说明书

本发明公开一种南瓜抗坏血酸氧化酶的提取纯化方法，将青皮南瓜洗净后加入食盐，再粉碎得到粉碎液；将粉碎液经固液分离，所得分离液用板框过滤得到澄清液；在所得澄清液中加入所得吸附颗粒，搅拌后，经固液分离得到清液，再经浓缩、灭菌、干燥，即得干燥的抗坏血酸氧化酶。本发明能有效去除叶绿素，提高抗坏血酸氧化酶产品的纯度。生产过程中产物易与水分离，便于按需要的活性获得浓缩液，且灭菌效果好，产品合格率高。本发明工艺条件温和，方法简便，生产成本低，过程易于控制，对设备要求低，能耗低。本发明所得抗坏血酸氧化酶产品收率达80％以上，纯度达99％以上。

技术领域

本发明涉及一种南瓜抗坏血酸氧化酶的提取纯化方法。

背景技术

抗坏血酸氧化酶(ASO)是以分子氧为底物的氧化酶类，它隶属于蓝色氧化酶类，酶分子活性部位含有多个金属铜离子，在催化还原性有机底物单电子氧化的同时，为氧分子(O₂)提供四个电子，将其直接还原成H₂O。国际酶学委员会将其命名为L-抗坏血酸:O₂氧化还原酶，编号为：EC 1.10.3.3。ASO对还原性底物要求较高，仅作用于L-抗坏血酸和其它有在羰基邻近含烯二醇基团的内酯环结构的化合物。ASO广泛存在于自然界，已从南瓜、黄瓜、柑桔等多种植物和微生物中得以纯化，许多研究集中在酶的分离纯化、细胞定位、分子结构、理化性质、催化机制和酶学特征，已阐明其三维结构、糖链结构和铜结合位点，已从南瓜和黄瓜中克隆出该酶的cDNA，并和其它含铜化酶的一级结构比较了同源性。

目前，通过南瓜提取纯化得到ASO的方法中还存在产品纯度不高，叶绿素难以去除等问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种南瓜抗坏血酸氧化酶的提取纯化方法，以更优化地去除叶绿素。

本发明通过下列技术方案实现：一种南瓜抗坏血酸氧化酶的提取纯化方法，经过下列各步骤：

(1)将青皮南瓜洗净后削皮，以瓜皮为原料，加入瓜皮质量1～3％的食盐，再按固液质量比为1:2加水混合后粉碎，得到粉碎液；

(2)将步骤(1)所得粉碎液经固液分离，所得分离液用醋酸调节pH值至5.0，再用板框过滤得到澄清液；

(3)按水：乙醇：纳米级硫酸铜：氨水的体积比为40～60：2～10：25～45：2～10，将氨水、乙醇、水和纳米级硫酸铜混合后，在室温下搅拌10～16小时，再加入硝酸溶液调节pH值为4～6，并继续搅拌70～120分钟，经离心清洗后，即得到表面改性的微球；将所得表面改性的微球超声分散到0.01mol/L的硝酸溶液中，在搅拌情况下，按微球质量的0.05～1％加入聚乙二醇-4000，然后按微球质量的2～50倍加入柠檬酸，搅拌30～90分钟以上，用去离子水离心沉积和超声分散循环的清洗方式，去除所得微球的反应残余物，即得到吸附颗粒；

(4)按固液比mg/L计为1:4～10，在步骤(2)所得澄清液中加入步骤(3)所得吸附颗粒，搅拌60～120分钟后，经固液分离得到清液；

(5)浓缩：用8000K～10000K的卷式膜浓缩机浓缩，按需要的活性确定浓缩倍数，即可得到浓缩液；

(6)灭菌：用0.45u孔径的膜过滤机把细菌过滤掉，得到无菌浓缩液(细菌的分子量都在0.6u以上)；

(7)干燥：用冷冻真空干燥机把无菌的浓缩液冻干即得干燥的抗坏血酸氧化酶。

所述步骤(3)的聚乙二醇-4000和柠檬酸为市购分析纯产品。

所述步骤(4)的搅拌由超声波震荡操作替代。

所得干燥的抗坏血酸氧化酶用80目的粉碎机打粉，经检测活性、微生物指标合格后即为成品。