[发明专利]一种基于人工减数分裂的辅助基因组组装方法

说明书

本发明公开了一种基于人工减数分裂的辅助基因组组装方法，将基因组以克隆文库的形式等分，建立随机的人工减数分裂样本，并通过HpaII甲基转移酶和FspEI甲基修饰依赖型内切酶进行处理，形成高密度的分型标记，进而分析获得分型标记的排序信息，实现scaffold的进一步组装或者Pacbio测序reads直接串联组装。本发明基于人工减数分裂的组装策略，具有实验操作简单、周期短、成本低等优点，能够在有限的人力物力条件下进行高覆盖率和准确率的基因组拼接，在基因组相对复杂并且高度杂合的物种中有更大的应用前景。

技术领域

本发明涉及基因组学领域，具体地说，涉及一种基于人工减数分裂的辅助基因组组装方法。

技术背景

基因组DNA序列是生物体遗传信息的主要载体，借助全基因组测序以及对序列信息的解读，可以在分子水平上揭示许多重要物种的生长发育原理，也可以在群体水平上探究个体之间基因的差异变化，对探索与认识生命本质等基础生物科学研究、人类重要遗传病防治及动植物遗传育种等应用性研究均具有十分重要的意义。

全基因组测序技术由第一代双脱氧链终止法到边合成边测序的第二代测序方法，再发展到以单分子纳米孔为标志的第三代测序技术。其中二代测序技术相比其他测序技术具有通量高，准确性高，单碱基分辨率及成本低的巨大优势，目前仍然是是基因组测序的首选平台。

随着基因组测序数据爆炸式增长，与之相配套的基因组组装方法也在迅速发展。最先开展的人类基因组计划中采用的是克隆重叠群法进行基因组组装，主要是通过福斯质粒(Fosmid)克隆或者细菌人工染色体(BacterialArtificial Clone，简称BAC)克隆的指纹信息对克隆进行排序，以确定涵盖基因组的最少克隆集合，然后测定这些去冗余的克隆片段，最后实现基因组的拼接。相对人类基因组计划采取的策略，CraigVenter提出的鸟枪法省去了构建物理图谱的繁琐过程，利用基于重叠群的图算法将从基因组中测序得到的高覆盖度的片段交给计算机来组装，但其通量低，价格昂贵，不易大范围推广。后来发展出的一套以k-mer为节点的De bruijn图策略成为现阶段基因组组装的主流计算技术，代表性软件有Velvet、ALLPATH-LG、ABySS、Bambus、CABOG、MSR-CA、SGA、SHARCGS、SSAKE及SOAP-denovo等。

由于基因组中存在着大量的重复序列，导致二代测序数据在组装过程中的Contigs比较短，拼接获得的基因组草图仍然有不少的Scaffolds/Contigs仍未挂载到染色体水平，而且对于高重复，高杂合，以及复杂区域，其组装结果往往差强人意，很大程度上限制了参考基因组序列的可靠性和完整性，单纯依靠二代测序数据拼接难以达到很好的组装效果，因而借助遗传图谱及物理图谱以及新发展起来的三代测序技术等手段辅助基因组拼接的作用就显得尤为重要。

SMRT单分子实时测序技术、BioNano光学图谱技术、体外Hi-C技术等新技术的兴起和发展，使基因组组装水平提升到一个新的高度。这些方法的技术聚焦在远距离长片段的定位，能有效解决一些拼接难度较大的重复区，但其应用通常需要配置昂贵的检测仪器，具有较高的成本，并且这些新兴的技术手段不能获得基因组全局性的序列连接信息，只能提升基因组部分片段的组装效率，因此要将基因组组装达到染色体水平，仍然离不开传统的遗传图谱或物理图谱。

遗传图谱的方法是利用减数分裂时期的姊妹染色单体联会后不同DNA片段共交换的频率来判断DNA片段的相对位置，但对于某些生长周期较长的物种，构建作图群体会消耗较多的时间，如要提高定位精度，还需要扩大作图群体来获得更高的标记密度，并且挂载确定Scaffolds/Contigs的染色体位置容易受限于物种的群体规模和交换频率。因此辅助基因组拼接更为经典的可靠方式是基于物理图谱的方法，即通过构建相应的BAC克隆文库，然后通过限制性内切酶酶切这些大片段，然后将这些大片段指纹信息展示出来，以此构建比较完整的物理图谱。