[发明专利]一种用于白血病治疗的细胞冻存液

说明书

本发明提供了一种细胞冻存液及其制备方法。该细胞冻存液包括二甲基亚砜5%w/v，0.5%w/v低密度脂蛋白，1%w/v的海藻糖，1%w/v卵磷脂，多肽1%w/v，bFGF 1%w/v，维生素E 1%w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml。本发明提供的细胞冻存液用于冻存培养细胞，特别是提高了冻存细胞复苏后的存活率。具有较好的应用前景。

技术领域

本发明涉及组织细胞培养技术领域，具体涉及一种细胞冻存液及其制备方法和应用。

背景技术

干细胞(stem cell)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞(专能干细胞)。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。在脑、脊髓等所有神经组织中，不同的神经干细胞类型产生的子代细胞种类不同，分布也不同。虽然该细胞利用广泛，但要广泛地应用于临床治疗领域，其来源和数量仍远远不能满足需求。因此神经干细胞的体外大规模扩增，以及将扩增后的细胞进行冷冻保存，是本领域技术人员迫切的需求。

白血病是危害人类的重要的肿瘤之一，在白血病治疗和研究中，对于白血病干细胞的瞬时需求量很大，而传统的分离方法不可能马上获得，因此，批量贮存，一起取出应用是必要的，但是常规的贮存方法效果不好，而冷冻的方法却有很大的局限性。这是因为细胞冻存的过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，同时伴随生物性损伤的危险。影响冻存效率的因素主要有：细胞浓度、冷冻速率以及冻存液。目前，干细胞冻存使用的冻存液有含血清和无血清的两类，由于血清具有成分复杂、质量不稳定、价格昂贵等缺点，无血清冻存和复苏技术成为发展趋势。低温保存干细胞主要依靠抗冻液二甲基亚砜(DMSO)和血清的保护。常用到的细胞保护剂还有羟乙基淀粉0ES)、聚乙二醇(PEG)等。但是，DMSO会对细胞产生毒性作用，对冻存的干细胞造成不可逆的损伤。为获得来源方便的干细胞，开展有效的干细胞冻存方法是本领域迫切的需求，建立一种长期低温保存干细胞的方法对于促进神经干细胞的研宄和应用具有重大意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种细胞冷冻保存液以及相应的制备方法及使用方法。

本发明的技术方案如下：

一种细胞冷冻保存液，其特征在于由如下各组分组成：其特征是冷冻存液中含有:二甲基亚砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bFGF 1％w/v，维生素E 1％w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，所述多肽的序列如SEQ ID NO：1-16任一所示。所述多肽有申请人通过前期的大量的基因库筛选得到，所述多肽具有保护细胞免受损伤的功能。其名称及序列如下：BX-1、BX-3、BX-4、BX-6、BX-7、BX-9、BX-11、BX-12、BX-14、BX-15、BX-17、BX-19、BX-22、BX-23、BX-25；其依次对应于SEQ ID NO：1-15。

在本发明的细胞的冻存液中，海藻糖以及维生素E和多肽具有明确的抵御外来伤害对细胞的损伤，特别是多肽，还具有保护细胞免受冻存时冰结晶对细胞的损伤。

本发明还提供了一种细胞的冻存液的制备方法，即将所述各组分混合摇匀即成。

本发明还提供了一种神经细胞冻存方法，包括以下步骤:

A.冻存液制备:制备所述的细胞冻存液，将各组分按照常规的操作方法将各组分按照相应的比例混合即可获得；

B.细胞悬液制备:培养生长成单层的神经细胞一瓶，0.20％胰蛋白酶液消化4分钟，弃胰酶液，加入DMEM培养液15ml，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，离心4000转/分，弃上清，加入步骤A冻存液2ml，混均，置入无菌的冻存管内；