[发明专利]一种鉴别移栽黄芪和野生黄芪的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴别移栽黄芪和野生黄芪的方法，具体属于荧光辅助凝胶电泳技术，以黄芪多糖部分酸水解后差异性糖片段的含量为鉴定依据的移栽黄芪和野生黄芪的鉴别方法。

背景技术

传统的野生黄芪主要是指生长年限在5年以上、自然繁殖或人工撒种后自然生长的蒙古黄芪或膜荚黄芪。野生的蒙古黄芪主要分布在山西、内蒙、甘肃、陕西等省，其中山西和内蒙古产的5～8年生的蒙古黄芪为道地药材，具有“主根粗长、少分支、绵性大、粉性强、甜味足、豆腥味浓”等特点。野生膜荚黄芪主产区为黑龙江、吉林，生长年限在6年以上，商品量极小。移栽黄芪主要是指生长年限在1～3年、人工栽培的蒙古黄芪或膜荚黄芪。生长2～3年的移栽黄芪主要分布在甘肃、宁夏、内蒙古等省，以蒙古黄芪为主；河北、山东也有栽培一年即采收上市的膜荚黄芪。这种移栽黄芪外观与野生黄芪有较大差别，呈现“主根短，分枝多，质坚硬，鸡爪形，微甜而淡”等特征。二者的化学成分有差异导致其药效不同，虽然黄芪根部形态特征有明显区别，但制备成饮片或打粉后，肉眼难以区别。因此，近年来药材市场上出现了两种黄芪混杂现象，扰乱了中药材市场。

临床研究表明，糖类成分是黄芪发挥免疫调节作用的主要物质。因此，将糖类成分作为黄芪质量控制与品质评价的标准，具有良好的研究前景和意义。国内外学者也采用苯酚硫酸法测定总多糖含量比较不同生长年限、不同栽培方式的黄芪，然而，所测定的指标缺乏专属性特征，限制了应用多糖作为黄芪鉴别的方法。授权公告号为104122287B的发明专利公开了一种野生黄芪和栽培黄芪的鉴别方法，该方法通过核磁技术获得黄芪药材的核磁共振氢谱，对蔗糖、α-葡萄糖和β-葡萄糖信号分别进行手动积分，计算蔗糖和葡萄糖的积分面积比值，根据比值的范围鉴别野生黄芪和栽培黄芪。申请公布号CN106093240A公开了一种速生黄芪和野生黄芪的鉴别方法，该方法利用气相色谱质谱技术分析黄芪中细胞壁糖类成分，从而区分速生黄芪和野生黄芪。上述方法中使用核磁技术和气相色谱质谱技术，其实验成本高、操作复杂而且实验数据处理较为繁琐，不适于普及和推广。

发明内容

本发明的目的是解决现有移栽黄芪和野生黄芪鉴别方法专属性低、操作复杂、实验成本高的技术问题，提供一种鉴别移栽黄芪和野生黄芪的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种鉴别移栽黄芪和野生黄芪的方法，包括如下步骤：

1)原料预处理：将干燥的黄芪粉碎成粉末后过100目筛得到黄芪细粉，备用；

2)提取粗多糖：取上述黄芪细粉加水后在100℃的温度下回流提取1h，降至室温后离心取上清液；残渣再加水重复提取1次，取上清，合并上清液；浓缩，将合并的上清液用95％的乙醇调节至含醇量为80％，3000r/min离心10min，合并沉淀，冷冻干燥得多糖粗粉；

3)纯化多糖：将步骤2)得到的多糖粗粉溶于水中，得到多糖粗粉溶液，所述多糖粗粉与水的质量比为1:200，向多糖粗粉溶液中加入浓度为10.6％的亚铁氰化钾溶液和浓度为21.9％的乙酸锌溶液，所述浓度为10.6％的亚铁氰化钾溶液和浓度为21.9％的乙酸锌溶液的加入量均为多糖粗粉溶液体积的10％，振摇后静置30min，离心得到纯化多糖，冻干，备用；

4)多糖酸水解：取步骤3)得到的纯化多糖10mg，加入0.5mol/L三氟乙酸500μL，混匀，随后将混合液置于90℃保温1h，反应结束后，用氮吹干燥仪干燥多糖酸水解产物，然后加入适量甲醇清洗水解产物，继续氮气吹干；

5)多糖酸水解产物、三糖标准品和四糖标准品的衍生化：取三糖标准品6mg、四糖标准品8mg以及步骤4)中的多糖酸水解产物，分别加入200μL的NaCNBH3溶液，再分别加入200μL的ANTS衍生化试剂，涡旋，混匀；37℃恒温反应15h后，将三种产物用氮气吹干，溶于1mL6mol/L的尿素溶液，制成三糖标准品、四糖标准品及多糖酸水解产物的衍生化样品，其中三糖标准品和四糖标准品的衍生化样品用6mol/L的尿素溶液分别稀释成不少于6个浓度梯度的衍生化样品；

6)衍生化样品电泳分析：取步骤5)中多糖酸水解产物衍生化样品、三糖标准品衍生化样品和四糖标准品的衍生化样品，采用垂直板凝胶电泳分离每个衍生化样品，分离胶为浓度为30％的聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶为浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶，电泳缓冲液为pH8.0-9.0、浓度0.1-0.2mol/L的Tris-boric，上样量为1-3μL，凝胶在UV300nm条件下成像，获得多糖酸水解产物衍生化样品、三糖标准品衍生化样品和四糖标准品衍生化样品的电泳图；