[发明专利]一种均相检测SCCA1的免疫荧光法

说明书

技术领域

本发明公开了一种均相检测SCCA1的免疫荧光法，属于纳米免疫分析技术领域。。

背景技术

荧光共振能量转移（FRET）是指在两个不同的荧光基团中，若一个荧光基团（供体Donor）的发射光谱与另一个基团（受体Acceptor）的吸收光谱有一定的重叠，两个荧光基团间的距离合适时（一般小于10 nm），即可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象。

量子点（QDs）是直径约为2~20nm，能够接受激发光产生荧光的半导体纳米颗粒。传统的FRET研究的主要集中于有机荧光分子数，作为一种新型FRET试剂，QDs具有许多有机荧光分子不具备的优点，如有可调谐的激发波、抗漂白性、多个染料分子同时连接、狭窄的发射波长和远离发射峰激发等优良的光学性质。因此，QDs可以成为比有机荧光分子更好的FRET的供体或受体。

荧光能量转移体系发光强度大，灵敏度高，方法简单。

发明内容

本发明的目的在于提供一种均相检测SCCA1的免疫荧光法，利用荧光配对染料之间荧光共振能量转移快速均相检测广谱肿瘤标记物SCCA1。该方法可以在均相中实现对SCCA1的检测，且对SCCA1的检测具有灵敏度高和选择性好的特点。

本发明采用以下技术方案：

一种基于荧光共振能量转移的SCCA1检测法，包括以下步骤：

一、探针1和探针2的制备

A、CdS的制备

在合成过程保持搅拌状态的体系中，将0.1 mol/L的CdCl₂溶液2~8 mL注入到100 mL去离子水中，加入0.2~2.0 mmol的巯基乙酸作为修饰剂，2~5min后用1 mol/L的氢氧化钠溶液调节体系pH值至9~11，溶液体系呈无色透明，随后加入0.5~4 mL浓度为0.1 mol/L的Na₂S水溶液，即得CdS量子点。

B、取CdS量子点分别用0.05M的MES缓冲溶液稀释后，加入EDC和NHS（QDs: EDC的摩尔比为1:50～1:200；EDC: NHS的摩尔比为1:1～1:5），涡旋振荡均匀，室温活化15～60 min；将活化的量子点用30 KD超滤管在8000 r/min，4℃条件下离心10 min，超滤纯化后，加入PBS7.4稀释，加入相对应单克隆SCCA1抗体溶液（QDs和抗体的摩尔比为1:1～10:1），4℃反应过夜，即得探针1。

C、取荧光物质（罗丹明B或红色荧光微球）分别用0.05 M的MES缓冲溶液稀释后，加入EDC和NHS（荧光物质: EDC的质量比为1:50～1:200；EDC:NHS的摩尔比为1:1～1:5），涡旋振荡均匀，室温活化15～60 min；将活化的荧光物质用30 KD超滤管在8000 r/min，4℃条件下离心10 min，超滤纯化后，加入PBS7.4稀释，加入相对应单克隆SCCA1抗体溶液（荧光物质和抗体的质量比为100:1～10:1），4℃反应过夜，即得探针2。

其中，罗丹明激发波长525-550nm，发射波长580 nm；红色荧光微球激发波长520～535 nm，发射波长600 nm。罗丹明B购于sigma；红色荧光微球购于苏州为度生物。

二、探针1-SCCA1-探针2荧光共振能量转移体系制备

探针1-SCCA1-探针2荧光共振能量转移体系的原理如图1所述，通过探针1、探针2与SCCA1形成三明治结构，使探针1、2的标记荧光物质发生能量荧光转移，而这种荧光变化量的大小与SCCA1的含量呈一定的线性关系。

探针1-SCCA1-探针2荧光共振能量转移体系为：

样本（标准品或待测样本） 2 μL

0.05mg/mL探针120 μL

0.05mg/mL探针2 10μL

PBS7.4缓冲液 50 μL

ddH₂O补足至100 μL 。

三、SCCA1工作曲线

先将浓度为0.05~40 ng/mL的不同浓度的标准品样本分别与探针1、PBS缓冲液接触混匀后，分别加入探针2，超纯水定容到100 μL。然后常温旋转30~60 min后，将该体系置于多功能酶标仪上检测荧光强度。记录混合液在探针2最大发射波长（580 nm或600 nm处）的荧光强度，存在SCCA1时F，不存在SCCA1时F₀，以(F-F₀)对SCCA1浓度绘制标准曲线。