[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9技术制备水稻OsPIL15突变体的方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于CRISPR/Cas9技术制备水稻OsPIL15突变体的方法及应用，属于植物基因工程技术领域。

背景技术

基因编辑技术指能够对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、插入等。近年来，一种名为CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9，Cas9)的基因组定向编辑技术备受瞩目。2013年初，《Science》两篇文章首次报道了Cas9核酸酶用于人类和小鼠细胞基因组编辑(Mali et al.,2013；Cong et al.,2013)，其作为第三代基因编辑技术受到人们广泛关注。CRISPR/Cas9技术是利用核酸酶Cas9蛋白与单导向RNA(Single guide RNA,sgRNA)形成复合体，sgRNA通过碱基互补配对决定靶序列特异性，Cas9蛋白作为核酸酶切割与sgRNA上的间隔序列(spacers)互补的基因组DNA，造成双链DNA损伤，随后通过体内的NHEJ(non-homologous end joining)修复机制引入基因突变(Wiedenheft et al.,2012)。随着CRISPR/Cas9系统在人类和动物细胞中建立与应用，CRISPR/Cas9系统在拟南芥、烟草、水稻、小麦、玉米、高粱、番茄和甜橙等植物中均实现了基因组的定向编辑(Belhaj et al.,2015；Doudna et al.,2014)。

水稻是世界上最主要的粮食作物之一，为全球半数以上人口提供食物来源。水稻的稳产和增产对保障我国粮食安全具有重要的战略意义。水稻产量主要由产量构成三要素穗数、每穗粒数和千粒重所决定，而粒重是决定产量三要素中遗传力最高的因素。粒重主要由籽粒大小和籽粒充实度所决定，而籽粒大小又主要由粒长、粒宽和粒厚所控制(Xing et al.,2015)。目前，随着突变体研究加速以及图位克隆和QTL等生物技术手段的运用，许多粒长、粒宽和粒重相关性状基因(GS3、GS5、GW2、GW5、GW7和GW8)相继被克隆(Song et al.,2007；Jianfeng et al.,2008；Mao et al.,2010；Li et al.,2011；Wang et al.,2012；Wang et al.,2015)。其中GS3是控制水稻粒重和粒长的主效QTL，在调节籽粒和器官大小中发挥负调节子的功能；GS5编码一个丝氨酸羧肽酶，是一个控制水稻粒宽、充实度和千粒重的数量性状基因；GW2编码一个环型E3泛素连接酶，负调控籽粒粒宽和粒重；GW5可通过影响泛素化降解途径控制籽粒粒宽和粒重；GW7可通过改变细胞分裂模式控制水稻粒形和提升稻米品质；GW8是一个包含SBP结构域的转录因子，能够直接与GW7启动子结合并抑制其表达，从而控制籽粒大小和品质。对这些基因的研究为水稻育种提供了重要理论依据，部分产量相关基因已被广泛应用于水稻高产稳产品种培育中。

光敏色素互作因子PIFs(Phytochrome-Interacting Factors)或称PILs(Phytochrome Interacting Factor-Like)是bHLH转录因子家族中的一类转录因子，其主要特性是能与光敏色素互作直接或间接调控光响应基因。作为bHLH蛋白的一种，所有PIFs家族的蛋白都包含在N端与光敏色素互作的APB(Active Phytochrome B-binding)或APA(Active Phytochrome A-binding)结构域和C端bHLH-DNA结合结构域及核定位结构域(Shen et al.,2008；Khanna et al.,2004)。在水稻中，通过同源性分析在水稻基因组中鉴定了6个PIF转录因子(OsPIL11-OsPIL16)(Nakamura et al.,2007)。OsPIL13在水稻中超表达后能够促进水稻节间的伸长，反之低表达则抑制其节间伸长(Todaka et al.,2012)，超表达OsPIL15的水稻种子在黑暗环境中的萌发受到抑制(Zhou et al.,2014)，OsPIL16能够负调控PGL1进而调控籽粒大小(Heang et al.,2012)。因此，构建光敏色素互作因子OsPIL15突变体对于水稻种子增重、增产等育种领域具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于CRISPR/Cas9技术制备水稻OsPIL15突变体的方法。

本发明还提供了上述方法制得的突变体在水稻育种中的应用。